基因編輯技術最具代表性的就是在人類疾病動物模型制備方面的應用。隨著經濟發(fā)展，代謝性疾病的發(fā)病率逐年增高，其中心血管疾病導致的死亡占我國居民全部死因的40%以上，死亡率居于首位^[1]。通過構建包括心血管疾病、糖尿病等代謝領域基因編輯小鼠模型，并進行多種深入研究，可以找到相關疾病的潛在治療靶點，研究靶點作用機制，推進藥物研發(fā)領域的發(fā)展。

G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptors，GPCRs）家族，作為最大的藥物靶標蛋白家族，家族成員800多個且分布廣泛，與多種疾病的發(fā)生和進展過程有所關聯(lián)。GPCR藥物研發(fā)具有非常重要的價值，靶向GPCR靶點藥物總計475種獲批，涵蓋108個GPCR靶點，開發(fā)創(chuàng)新的藥物變得的愈發(fā)重要^[2]。GPCR家族的基因編輯動物模型研究也為開發(fā)創(chuàng)新靶點藥物提供了契機。本篇內容小編為大家分享GCPR靶點基因敲除小鼠在部分代謝疾病研究中的應用。
 

 

圖1. G蛋白偶聯(lián)受體信號通路^[3]

 

GPCR靶點基因編輯小鼠模型與代謝疾病相關研究

 

心血管疾病

動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是一種復雜的慢性炎癥疾病，是大多數(shù)心血管疾病 (Cardiovascular diseases, CVD) 的根本原因，它的炎癥過程由免疫細胞網絡及其隨后的反應所促進。細胞網絡由多種炎癥介質協(xié)調，它們相互作用、結合并誘導信號傳導。GPCRs 成為識別這些介質的重要參與者，由于其介導的功能效應種類繁多而成為有前景的藥理學靶點，它們與許多在動脈粥樣硬化發(fā)展中起關鍵作用的過程有關。Chemerin受體23（ChemR23，也稱為CMKLR1）是一種表達在免疫細胞亞型（如樹突狀細胞、巨噬細胞等）表面的A類GPCR蛋白。ChemR23可維持M1巨噬細胞表型，刺激pDC遷移和浸潤動脈粥樣硬化斑塊（圖2）。

 

圖2. 各種 GPCR 參與動脈粥樣硬化發(fā)展的示意圖^[4]

近期有研究采用Apoe^-/-ChemR23^-/-小鼠模型進一步證明Erv1/Chemr23 的靶向缺失與巨噬細胞中促動脈粥樣硬化信號、氧化低密度脂蛋白攝取增加、吞噬作用減少以及動脈粥樣硬化斑塊大小和壞死核心形成增加相關。表明ChemR23具有一定的抗動脈粥樣硬化作用（圖3）^[5]。
 

 

圖3. Apoe^-/-xErv1/ChemR23^-/-小鼠增強動脈粥樣硬化，促進斑塊成分和基因表達的改變

 

與心血管疾病相關的GPCR成員主要分布于A類家族的α亞類，如人體最重要的神經體液調節(jié)系統(tǒng)之一，血管緊張素系統(tǒng)（RAAS）中的AT1R、AT2R以及Mas-R。血管緊張素II（AngII）1 型受體（AT1R）可自發(fā)激活。通過膜環(huán)境、相互作用蛋白、受體自身抗體和單核苷酸多態(tài)性（SNP）等增加AT1R表達的途徑，可以在 AngII 缺失的情況下，增加G蛋白信號^[6]。

Yasuda^[7]等人首次證明野生型hAT1R表達的心臟特異性上調會導致自發(fā)性收縮功能障礙和心腔擴張，并伴隨遺傳性血管緊張素原（Agt）缺陷小鼠的嚴重間質纖維化，通常認為 AngII 與 hAT1R 結合可啟動信號轉導通路。為了闡明AngII非依賴性AT1R激活在心臟中的致病作用，將在α-肌球蛋白重鏈 (MHC) 啟動子控制下過表達hAT1R的轉基因小鼠與Agt敲除小鼠雜交，建立 AT1^Tg-Agt^KO 雜交小鼠，其中AngII的產生存在遺傳缺陷。在AT1^Tg 親代小鼠中，hAT1R 的過度表達在內源性 AngII 水平存在的情況下可誘導心臟重塑。具有內源性 AT1R 表達水平的 Agt 缺陷小鼠未出現(xiàn)病理學變化。當 AngII 生成受到基因抑制時，由于天然 hAT1R 的過表達，體內組成性活性的增強可能導致心臟異常^[8]。
在各種激素、細胞因子、炎癥或代謝應激下，心臟和血管中AT1R的上調將成比例地增強 AT1R 的組成活性，并加速這些組織中的疾病發(fā)展。
 

 

圖4. 組成性活性 AT1R 信號轉導機制^[6]

 

目前研究人員已經發(fā)現(xiàn)多種疾病基礎上的GPCR突變，并開發(fā)了表達這些突變的轉基因小鼠及相關GPCR的基因編輯小鼠作為人類疾病的動物模型，證實了GPCR 家族為心血管疾病的治療提供了新的視角。

2型糖尿病
 

2型糖尿�。═ype 2 diabetes mellitus，T2DM）是一種復雜的多基因疾病，其病人存在著明顯的胰島素抵抗，胰島素信號轉導缺陷是產生胰島素抵抗的重要機理，同時也影響胰島素的分泌。隨著基因技術的快速發(fā)展，利用基因敲除技術探其在產生胰島素抵抗和胰島素分泌缺陷中的作用已成為該領域的研究熱點^[9]。
 

 

圖5. GLP-1的生理作用^[10]

 

人胰高血糖素樣肽-1受體（GLP-1受體，GLP-1R）是GPCR家族B類家族的一員，分布于產生胰島素的胰腺細胞表面，GLP-1與其結合后激活腺苷酸環(huán)化酶產生cAMP，同時增強葡萄糖刺激的胰島素分泌。GLP-1促進β細胞胰島素分泌可通過兩種方式，其一是通過蛋白激酶A(PKA)信號途徑磷酸化分泌顆粒相關蛋白質，以促進Ca2+依賴的胰島素胞外分泌；另一作用是通過鳥嘌呤核苷酸交換因子(cAMP-regulated guanine nucleotide exchange factor)介導^[11]。
 

 

圖6. GLP-1促進胰島素分泌的機制^[11]

 

GLP-1通過GLP-1R發(fā)揮作用，它可刺激胰腺產生胰島素并抑制胰高糖素的分泌，從而發(fā)揮其對胰島β細胞的增殖及抗凋亡作用，可通過減緩胃排空速度調節(jié)血糖以保持動態(tài)平衡。研究表明GLP-1R敲除小鼠可免受高脂飲食誘導的胰島素抵抗，抑制胰高血糖素分泌和延遲胃排空，從而減少餐后血糖波動^[12]。此外還有研究表明GLP-1與骨代謝也有密不可分的聯(lián)系，可通過降鈣素依賴途徑抑制破骨細胞，增加骨量，GLP-1R在成骨細胞前體表達，GLP-1R基因敲除小鼠還可引起骨質疏松癥。因此，糖尿病與骨代謝具有一定的相關性^[13]。

GLP-1的發(fā)現(xiàn)及功能研究為糖尿病治療藥物的開發(fā)提供了新的策略，目前已有幾類靶向于GLP1R的多肽類藥物已獲批用于2型糖尿病的治療，包括Exenatide、Liraglutide、Lixisenatide、Albiglutide及Dulaglutide等^[14]�？诜�型靶向GLP1R的多肽藥物和小分子藥物正處于臨床試驗中。

 

小結
 

基因編輯技術的發(fā)展和動物模型的開發(fā)，為代謝等領域疾病的早期發(fā)現(xiàn)及治療提供了強有力的手段，充分利用這些技術將進一步的研究疾病潛在的治療靶點與進展。
雖然目前僅有2例靶向GPCR的單克隆抗體獲得FDA批準，但研究熱度依然不減。GPCR家族蛋白成員具有7次跨膜，以及其天然的低表達率的特點使得可溶性GPCR抗原難以制備，抗體篩選困難。針對這類靶點采用基因敲除的全人抗體小鼠（RenMab+KO）進行抗體篩選，利用細胞系或多肽環(huán)作為抗原，將大大提高抗體篩選效率，推進藥物開發(fā)進展。

 

參考資料

[1] 中國心血管病報告；2018，國家心血管病中心，中國循環(huán)雜志

[2] Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schiöth, H. B., & Gloriam, D. E. (2017). Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications. Nature Reviews Drug Discovery, 16(12), 829–842.doi:10.1038/nrd.2017.178

[3] Dorsam, R. T., & Gutkind, J. S. (2007). G-protein-coupled receptors and cancer. Nature Reviews Cancer, 7(2), 79–94

[4] Emiel P. C. van der Vorst，Linsey J. F. Peters，et al．G-Protein Coupled Receptor Targeting on Myeloid Cells in Atherosclerosis，F(xiàn)ront. Pharmacol., 22 May 2019

[5] Laguna-Fernandez, A., Checa, A., Carracedo, M., Artiach, G., Petri, M. H., Baumgartner, R., … Bäck, M. (2018). ERV1/ChemR23 Signaling Protects from Atherosclerosis by Modifying oxLDL Uptake and Phagocytosis in Macrophages. Circulation, CIRCULATIONAHA.117.032801.

[6] Sadashiva S. Karnik，Hamiyet Unal. Angiotensin II Receptor-Induced Cardiac Remodeling in Mice Without Angiotensin II. Comment on Hypertension. 2012 Mar;59(3):627-33.

[7] Yasuda N, Akazawa H, Ito K, Shimizu I, Kudo-Sakamoto Y, Yabumoto C, Yano M, Yamamoto R, Ozasa Y, Minamino T, Naito AT, Oka T, Shiojima I, Tamura K, Umemura S, Nemer M, Komuro I. Agonist-independent constitutive activity of angiotensin II receptor promotes cardiac remodeling in mice. Hypertension. 2012;59

[8] Paradis P, Dali-Youcef N, Paradis FW, Thibault G, Nemer M. Overexpression of angiotensin II type I receptor in cardiomyocytes induces cardiac hypertrophy and remodeling. Proc Natl Acad Sci USA. 2000;97:931–936

[9] 周麗斌. 基因敲除技術在2型糖尿病研究中的應用．國外醫(yī)學：內分泌學分冊，2002，3：177一180．

[10] https://en.wikipedia.org/wiki/Glucagon-like_peptide-1

[11] 閔媛婷，盛德喬. GLP-1與2型糖尿病的研究進展. 生命的化學, 2015, 35(6): 751-756

[12] Julio E Ayala 1，Deanna P Bracy，eta1. Glucagon-like peptide-1 Receptor Knockout Mice Are Protected From High-Fat Diet-Induced Insulin Resistance[J].Endocrinology, 151 (10), 4678-87

[13] 王滌非. 胰島素受體底物-1在2型糖尿病發(fā)生發(fā)展中的作用研究. 中國醫(yī)科大學，2005.

[14] https://med.sina.com/article_detail_103_2_37458.html