水質糞大腸菌群的測定
濾膜法
1適用范圍
本標準規(guī)定了測定水中糞大腸菌群的濾膜法。
本標準適用于地表水、地下水、生活污水和工業(yè)廢水中糞大腸菌群的測定。
本方法的檢出限:當接種量為100ml時,檢出限為10CFU/L;當接種量為500ml時, 檢出限為2 CFU/L。
2規(guī)范性引用文件
本標準引用了下列文件或其中的條款。凡是不注日期的引用文件,其有效版本適用于本 標準。
GB/T 14581水質湖泊和水庫采樣技術指導
HJ494水質采樣技術指導
HJ/T91地表水和污水監(jiān)測技術規(guī)范
3術語和定義
下列術語和定義適用于本標準。
3. 1糞大腸菌群 fecaI col iforms
又稱耐熱大腸菌群(thermotolerant coliforms)。44.5°C培養(yǎng)24h,能在MFC選擇性培養(yǎng) 基上生長,發(fā)酵乳糖產酸,并形成藍色或藍綠色菌落的腸桿菌科細菌。
3. 2菌落形成單位 colony-forming un i ts (CFU)
單位體積樣品中的
細菌群落總數。
4方法原理
樣品通過孔徑為0.45um的濾膜過濾,細菌被截留在濾膜上,然后將濾膜置于MFC選 擇性培養(yǎng)基上,在特定的溫度(44.5°C)下培養(yǎng)24 h,膽鹽三號可抑制革蘭氏陽性菌的生長, 糞大腸菌群能生長并發(fā)酵乳糖產酸使指示劑變色,通過顏色判斷是否產酸,并通過呈藍色或 藍綠色菌落計數,測定樣品中糞大腸菌群濃度。
5干擾和消除
5.1活性氯具有氧化性,能破壞微生物細胞內的酶活性,導致細胞死亡,可在樣品采集(8.1) 時加入硫代硫酸鈉溶液(6.6)消除干擾。
5.2重金屬離子具有細胞毒性,能破壞微生物細胞內的酶活性,導致細胞死亡,可在樣品 采集(8.1)時加入乙二胺四乙酸二鈉溶液(6.7)消除干擾。
6試劑和材料
除非另有說明,分析時均使用符合國家標準的分析純試劑或生物試劑,實驗用水為蒸餡 水或去離子水。
1 MFC培養(yǎng)基:
胰腺 10 g
蛋白腺 5g
酵母浸膏 3g
氯化鈉 5 g
乳糖 12.5 g
膽鹽三號 1.5 g
1%苯胺藍水溶液 10 ml
1%玫瑰紅酸溶液(溶于8.0 g/L氫氧化鈉液中) 10 ml
將上述培養(yǎng)基中的成分(除苯胺藍和玫瑰紅酸外),溶解于1000 ml水中,調節(jié)pH至 7.4,分裝于三角燒瓶內,于115°C高壓蒸汽滅菌20 min,儲存于冷暗處備用。臨用前,按上 述配方比例,用滅菌吸管分別加入巳煮沸滅菌的1%苯胺藍水溶液1 ml及1%玫瑰紅酸溶液 (溶于8.0 g/L氫氧化鈉液中)1ml,混合均勻。如培養(yǎng)物中雜菌不多,則不加玫瑰紅酸亦 可。加熱溶解前,加入1.2%〜1.5%瓊脂可制成固體培養(yǎng)基。也可選用市售成品培養(yǎng)基。配 制好的培養(yǎng)基避光、干燥保存,必要時在5°C±3°C冰箱中保存,分裝到平皿中的培養(yǎng)基可 保存2〜4周。配制好的培養(yǎng)基不能進行多次融化操作,以少量勤配為宜。當培養(yǎng)基顏色變 化,或脫水明顯時應廢棄不用。
2 無菌濾膜:
直徑50 mm,孔徑0.45卩m的醋酸纖維濾膜,按無菌操作要求包扎,經12TC 高壓蒸汽滅菌20 min,晾干備用;或將濾膜放入燒杯中,加入實驗用水,煮沸滅菌3次,15 min/次,前2次煮沸后需更換水洗滌2~3次。
6. 3無菌水:取適量實驗用水,經121°C高壓蒸汽滅菌20 min,備用。
6.4 硫代硫酸鈉(Na2S2O3*5H2O)。
6.5 乙二胺四乙酸二鈉(CioHi4N208Na2.2H2。)。
6. 6 硫代硫酸鈉溶液:
p (NazSzCh) =0.10 g/ml
稱取15.7 g硫代硫酸鈉(6.4),溶于適量水中,定容至100 ml,臨用現配。
6.7 乙二胺四乙酸二鈉溶液:
p (Ci
0Hi
4N2O
8Na2-2H2O) =0.15 g/ml
稱取15 g乙二胺四乙酸二鈉(6.5),溶于適量水中,定容至100 ml,此溶液可保存30 d。
7儀器和設備
7. 1采樣瓶:1L、500 ml或250 ml帶螺旋帽或磨口塞的廣口玻璃瓶。
7.2高壓蒸汽滅菌器:115°C、12 PC可調。
7.3恒溫培養(yǎng)箱:允許溫度偏差44.5°C ±0.5°C »
7.4過濾裝置:配有砂芯濾器和真空泵,抽濾壓力勿超過-50 kPa。
7.5 pH計:準確到0.1 pH單位。
7. 6培養(yǎng)皿:直徑90 mm。
7.7 一般實驗室常用儀器和設備。
注:玻璃器皿及采樣器具試驗前要按無菌操作要求包扎,121笆高壓蒸汽滅菌20 min備用。
8樣品
8. 1樣品采集
點位布設及采樣頻次按照GB/T 14581、HJ/T494和HJ/T91的相關規(guī)定執(zhí)行。
采集微生物樣品時,采樣瓶(7.1)不得用樣品洗滌,采集樣品于滅菌的采樣瓶中。樣 品采集量可根據水體實際情況而定,一般不少于250 ml。
采集河流、湖庫等地表水樣品時,可握住瓶子下部直接將帶塞采樣瓶插入水中,約距水 面10-15 cm處,瓶口朝水流方向,拔瓶塞,使樣品灌入瓶內然后蓋上瓶塞,將采樣瓶從水 中取出。如果沒有水流,可握住瓶子水平往前推。采樣量一般為采樣瓶容量的80%左右。樣 品采集完畢后,迅速扎上無菌包裝紙。
從龍頭裝置采集樣品時,不要選用漏水龍頭,采水前將龍頭打開至最大,放水3〜5 min, 然后將龍頭關閉,用火焰灼燒約3 min滅菌或用70%〜75%的酒精對龍頭進行消毒,開足龍 頭,再放水1 min,以充分除去水管中的滯留雜質。采樣時控制水流速度,小心接入瓶內。
采集地表水、廢水樣品及一定深度的樣品時,也可使用滅菌過的專用采樣裝置采樣。
在同一采樣點進行分層采樣時,應自上而下進行,以免不同層次的攪擾。
如果采集的是含有活性氯樣品,需在采樣瓶滅菌前加入硫代硫酸鈉溶液(6.6),以除去 活性氯對細菌的抑制作用(每125 ml容積加入0.1 ml的硫代硫酸鈉溶液);如果采集的是重 金屬離子含量較高的樣品,則在采樣瓶滅菌前加入乙二胺四乙酸二鈉溶液(6.7),以消除干 擾(每125 ml容積加入0.3 ml的乙二胺四乙酸二鈉溶液)。
注:15.7 mg硫代硫酸鈉(6.4)可去除樣品中1.5 mg活性氯,硫代硫酸鈉用量可根據樣品實際活性氯 量調整。
8. 2樣品保存
采樣后應在2h內檢測,否則,應10°C以下冷藏但不得超過6h。實驗室接樣后,不能 立即開展檢測的,將樣品在4°C以下冷藏并在2 h內檢測。
9分析步驟
9. 1樣品過濾
根據樣品的種類判斷接種量,最小過濾體積為10ml,如接種量小于10ml時應逐級稀釋。 先估計出適合在濾膜上計數所使用的體積,然后再取這個體積的1/10和10倍,分別過濾。理 想的樣品接種量是濾膜上生長的糞
大腸菌群菌落數為20〜60個,
總菌落數不得超過200個。
當最小過濾體積為10 ml,濾膜上菌落密度仍過大時,則應對樣品進行稀釋。1:10稀釋的方法 為:吸取10ml樣品,注入盛有90 ml無菌水(6.3)的三角燒瓶中,混勻,制成1:10稀釋樣品。 樣品接種量參考
表見表1。
表1接種量參考表
樣品類型 |
接種量(ml) |
100 |
10 |
1 |
0.1 |
10-2 |
10-3 |
10-4 |
10-5 |
地表水 |
水源水 |
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▲ |
▲ |
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湖泊(水庫) |
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河流 |
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廢水 |
生活污水 |
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工業(yè)廢水 |
處理前 |
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處理后 |
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地下水 |
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用滅菌鑲子以無菌操作夾取無菌濾膜(6.2)貼放在己滅菌的過濾裝置(7.4)上,固定 好過濾裝置,將樣品充分混勻后抽濾,以無菌水(6.3)沖洗器壁2〜3次。樣品過濾完成后, 再抽氣約5 s,關上開關。
9.2培養(yǎng)
用滅菌鑲子夾取濾膜移放在MFC培養(yǎng)基(6.1)上,濾膜截留細菌面向上,濾膜應與培 養(yǎng)基完全貼緊,兩者間不得留有氣泡,然后將培養(yǎng)皿倒置,放入恒溫培養(yǎng)箱內,44.5°C ±0.5°C 培養(yǎng) 24h±2h。
9.3對照試驗
3. 1空白對照
每次試驗都要用無菌水(6.3)按照步驟9.1和9.2進行實驗室空白測定。
9. 3. 2陽性及陰性對照
將糞大腸菌群的陽性菌株(如大腸埃希氏菌Escherichia coli)和陰性菌株(如產氣腸桿 菌Enterobacter aerogenes)制成濃度為40~600 CFU/L的菌懸液,分別按照9.1~9.2步驟培養(yǎng), 陽性菌株應呈現陽性反應,陰性菌株應呈現陰性反應,否則,該次樣品測定結果無效,應查 明原因后重新測定。
10結果計算與表示
10. 1結果判讀
MFC培養(yǎng)基上呈藍色或藍綠色的菌落為糞大腸菌群菌落,予以計數。
MFC培養(yǎng)基上呈灰色、淡黃色或無色的菌落為非糞大腸菌群菌落,不予計數。 結果判讀參考圖片見圖1。
無菌落生長
圖1結果判讀參考圖片
10.2結果計算
樣品中的糞大腸菌群數(CFU/L),按照公式(1)進行計算:
八 Ci*1000C =
式中:C——樣品中糞大腸菌群數,CFU/L;
Ci——濾膜上生長的糞大腸菌群菌落總數,個;
1000——將過濾體積的單位由ml轉換為L ;
/——樣品接種量,ml;
注:若平行樣結果都在20〜60 CFU/L范圍內,最終結果取平均值以幾何平均計算。
10.3結果表示
測定結果保留至整數位,最多保留兩位有效數字,當測定結果N100CFU/L時,以科學 計數法表示。糞大腸菌群檢驗記錄及報告格式參見附錄A。
11精密度和準確度
11.1精密度
6個實驗室對低濃度(地下水,濃度均值為2.0X102 CFU/L)、中濃度(地表水,濃度 均值為
1.6X105CFU/L)和髙濃度(生活污水,濃度均值為1.6X107 CFU/L)三個不同濃度 糞大腸菌群的實際
樣品和有證標準樣品(濃度為3670 MPN7L,可接受范圍為330〜 7710MPN/L)進行了6次重復測定:
實驗室內相對標準偏差范圍分別為5.3%〜12%、0.81%〜 2.1%、0.51%〜4.2%和7.7%〜9.8%;實驗室間相對標準偏差分別為6.8%、3.9%、4.0%和3.6%; 實驗室間95%置信區(qū)間見表2 o
表2實驗室間95%置信區(qū)間
低濃度(CFU/L) |
中濃度(CFU/L) |
高濃度(CFU7L) |
標準樣品(CFU/L) |
均值 |
95%置信區(qū)間 |
均值 |
95%置信區(qū)間 |
均值 |
95%置信區(qū)間 |
均值 |
95%置信區(qū)間 |
2.0 X102 |
L4X102 〜
2.9 X102 |
1.6X105 |
9.8X104 〜
2.6X105 |
1.6X107 |
8.2 X"〜
3.0X107 |
6.1 X102 |
3.8X"〜
9.9X102 |
11.2準確度
6個實驗室對含糞大腸菌群濃度為3670MPN7L (可接受范圍為330-7710 MPN/L)的標 準樣品進行了6次重復測定:相對誤差范圍為-19%〜-32%;相對誤差最終值為:-23%±10%。
注:微生物檢測數據為偏態(tài)分布,其測定結果全部經以10為底對數轉換后進行計算。
12質量保證和質量控制
12. 1培養(yǎng)基檢驗
更換不同批次培養(yǎng)基時要進行陽性和陰性菌株檢驗,將糞大腸菌群測定的陽性菌株(如 大腸埃希氏菌Escherichia coli)和陰性菌株(如產氣腸桿菌Enterobacter aerogenes)配成適 宜濃度,按樣品過濾(9.1)的要求使濾膜上生長的菌落數為20〜60個,然后按培養(yǎng)(9.2)的要求進行操作,陽性菌株應生長為藍色或藍綠色菌落,陰性菌株應生長為灰色、淡黃色、 無色或無菌落生長。否則,該次樣品測定結果無效,應查明原因后重新測定。
12.2對照試驗
12.2. 1空白對照
每次試驗都要用無菌水做實驗室空白測定(9.3.1),培養(yǎng)后的培養(yǎng)基上不得有任何菌落 生長。否則,該次樣品測定結果無效,應查明原因后重新測定。
12.2.2陽性及陰性對照
定期按照9.3.2進行陽性及陰性對照試驗,陽性菌株應呈現陽性反應,陰性菌株應呈現 陰性反應,否則,該次樣品測定結果無效,應查明原因后重新測定。
13廢物處理
使用后的廢物及器皿須經121°C髙壓蒸汽滅菌30 min或使用液體消毒劑(自制或市售) 滅菌后,器皿方可清洗,廢物作為一般廢物處置。
14注意事項
當樣品渾濁度較高時,應選用其他方法。
表A. 1糞大腸菌群測定檢驗記錄
表A. 2糞大腸菌群測定數據報告格式