最近，新型冠狀病毒疫情一直揪著全國人民的心。從各地分離出毒株開始，到完成測序比對之后，普通民眾最關(guān)心的是我們的藥物和疫苗還要多久才能面世？科研界也在全力投入進(jìn)行病毒感染機(jī)制研究，以期早日“知其然知其所以然”，實現(xiàn)精準(zhǔn)防治。

 

冠狀病毒刺突糖蛋白（Spike）和受體ACE2是嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥（SARS-CoV）的關(guān)鍵結(jié)合位點。由于新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）和SARS-CoV的基因序列以及發(fā)病狀態(tài)等方面的相似性，使得科研界再一次將目光投向冠狀病毒刺突糖蛋白（Spike）和受體ACE2的研究。對Spike蛋白和宿主受體蛋白的結(jié)合位點分析意義重大，可以讓我們更清楚的了解該病毒的入侵方式，受體的作用機(jī)制，為當(dāng)前的新冠病毒入侵提供策略，為以后可能發(fā)生的冠狀病毒的防治鋪開道路。

 

冠狀病毒刺突糖蛋白（CoV Spike）蛋白結(jié)構(gòu)域分析

 

第一個要講的是冠狀病毒的Spike蛋白（S）。冠狀病毒的S蛋白分為S1和S2結(jié)構(gòu)域。S蛋白介導(dǎo)受體與病毒蛋白膜之間的融合方式通常是這樣的：

 

•S1負(fù)責(zé)與受體結(jié)合。S1結(jié)構(gòu)域的N末端與C末端均可與宿主受體結(jié)合。

 

•S2負(fù)責(zé)與宿主細(xì)胞膜融合。冠狀病毒S2含有多個關(guān)鍵分子，包括多個融合肽和兩個保守肽重復(fù)序列（HRs），來驅(qū)動病毒與宿主細(xì)胞之間的融合。HRs可以三聚成卷曲結(jié)構(gòu)，將病毒包膜和宿主細(xì)胞雙層緊密靠近，為融合的發(fā)生做準(zhǔn)備。

 

圖1. CoV Spike蛋白結(jié)構(gòu)示意圖

 

盡管SARS-CoV-2和SARS-CoV屬于不同種的菌株，但它們在用于鑒別的S1保守域中仍有約50個保守氨基酸保持一致，這說明SARS-CoV-2和SARS-CoV的結(jié)構(gòu)相似，且二者同屬于β冠狀病毒，而β冠狀病毒的受體結(jié)合域通常位于S1的C末端，如圖2所示。由此我們可以猜測，SARS-CoV-2的宿主受體是否和SARS-CoV的宿主受體相同？

 

圖2. 系統(tǒng)發(fā)育分析和SARS-CoV-2，SARS-CoV和MERS-CoV的受體結(jié)合域（引自Roujian Lu 2020）

圖A. 各種β冠狀病毒的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的系統(tǒng)發(fā)育分析。

圖B、C、D：SARS-CoV，SARS-CoV-2和MERS-CoV結(jié)合其宿主受體結(jié)構(gòu)域的比較。核心結(jié)構(gòu)用品紅表示，SARS-CoV，SARS-CoV-2和MERS CoV的外部子域分別是橙色，深藍(lán)色和綠色。受體結(jié)合位點中SARS-CoV和SARS-CoV-2之間的可變殘基突出顯示為棒狀。圖C SARS-CoV-2，❓表示新型冠狀病毒使用的受體仍然未知。(自2020年2月11日國際病毒分會為新冠病毒提供新的命名之后，本文均用SARS-CoV-2代替2019-nCoV。)

 

研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV要進(jìn)入受體，首先要通過病毒RBD（receptor binding domain）與細(xì)胞表面受體ACE2結(jié)合。那么SARS-CoV-2的S蛋白與人ACE2受體是否具有親和性呢？根據(jù)前期研究發(fā)現(xiàn)，使用HeLa細(xì)胞表達(dá)的ACE2可以作為SARS-CoV-2的受體，但是如何結(jié)合還有待進(jìn)一步研究。下面我們就來淺談一下ACE2蛋白的結(jié)構(gòu)。

 

ACE2受體蛋白結(jié)構(gòu)分析

 

ACE2是一種I型跨膜糖蛋白，包含一個由兩個α螺旋構(gòu)成的N端胞外域。病毒受體結(jié)合域RBD利用其外部結(jié)構(gòu)域與受體的N末端結(jié)合。如圖3所示。RBD凹表面有424-494殘基，也稱為受體結(jié)合基序（Receptor binding motif RBM），形成ACE2的N端螺旋與受體進(jìn)行接觸，所組成的復(fù)合物形成SARS-CoV RBD 927.8A˚2和ACE2 884.7A˚2的界面，該界面包含受體中的至少18個殘基和RBD中的14個殘基，形成了一個在RBD/ACE2相互作用中占主導(dǎo)地位的親水性接觸網(wǎng)絡(luò)。在與ACE2結(jié)合后，SARS-CoV包膜與宿主細(xì)胞膜之間的融合由S2亞基完成。

 

圖3. SARS-CoV及其受體ACE2結(jié)構(gòu)示意圖

（參考Guangwen Lu 2015）

綠色：RBD核心；品紅：RBD核外域；青色：ACE2 N末端；橙色：ACE2 C末端

 

SARS-CoV-2與SARS-CoV二者的序列具有79%的相似性，同時我們發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2 RBD序列，包括其RBM直接接觸ACE2的途徑也與SARS-CoV相似，于是研究者就猜測ACE2受體很可能是SARS-CoV-2感染人體的關(guān)鍵受體蛋白。

 

如圖4所示，與SARS-CoV相比，SARS-CoV-2 受體結(jié)合基序（RBM）除了在遠(yuǎn)離ACE2結(jié)合區(qū)環(huán)上插入了一個殘基之外不包含任何刪除和插入序列。

 

圖4. SARS-CoV和SARS-CoV-2對ACE2識別的結(jié)構(gòu)分析(參考Yushun Wan 2020)

A. 實驗確定SARS-CoV RBD和人類ACE2之間的界面結(jié)構(gòu)，SARS-CoV RBD上的五個殘基均經(jīng)過自然選擇，并顯示出對ACE2的識別以及進(jìn)入宿主細(xì)胞至關(guān)重要。

B. SARS-CoV-2 RBD與人ACE2之間的界面建模結(jié)構(gòu)。根據(jù)SARS-CoV與SARS-CoV-2之間的序列關(guān)聯(lián)，對應(yīng)出相應(yīng)的殘基編號。

 

在與ACE2接觸的病毒受體結(jié)合域的14個殘基中，SARS-CoV-2和SARS-CoV中有9個是完全保守的，有4個是部分保守的，下面我們就來分析這些殘基。

 

SARS-CoV病毒受體結(jié)合域中的殘基479位于人ACE2上的病毒結(jié)合位點Lys31（即hotspot-31）附近。Hotspot-31由埋在疏水環(huán)境中的Lys31和Glu35之間的鹽橋組成。K479N突變消除了RBD與人類ACE2界面的不利作用，增強(qiáng)了病毒與ACE2的結(jié)合，并使SARS-CoV從人到人的傳播中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。重要的是，SARS-CoV-2 RBD中的Gln493與hotspot-31兼容，這表明SARS-CoV-2能夠識別人ACE2并感染人類細(xì)胞。

 

而SARS-CoV-2 RBD中的501殘基（對應(yīng)于SARS-CoV中的487殘基）是天冬酰胺。根據(jù)研究者之前的結(jié)構(gòu)分析，SARS-CoV中的487殘基位于人ACE2上的病毒結(jié)合位點Lys353（即hotspot-353）附近。 Hotspot-353由Lys353和Asp38之間的鹽橋組成，該鹽橋也被埋在疏水環(huán)境中。在2002年分離出的人SARS-CoV中，487殘基是蘇氨酸，可增強(qiáng)353號熱點的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。S487T突變增加了RBD 與人類ACE2界面的相互作用，增強(qiáng)了病毒與人類ACE2的結(jié)合，并在人與人之間傳播SARS-CoV的過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

 

455、486和494殘基在SARS-CoV-2 RBD中分別為亮氨酸，苯丙氨酸和絲氨酸，分別對應(yīng)于SARS-CoV中的442、472和480殘基。研究者發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV RBD中的這三個殘基在ACE2結(jié)合中起著重要作用，盡管不如殘基479和487劇烈。

 

盡管存在氨基酸殘基的替換，但SARS-CoV-2的S蛋白與人ACE2受體仍然具有顯著的結(jié)合親和力。也就是說，hotspot-31和hotspot-353或許就是我們要研究的重要位點。但是由于小鼠或大鼠ACE2的353位含有一個組氨酸，它并不像賴氨酸那樣適合病毒與受體之間的相互作用，這對于中間宿主的篩選也提供了一項證明。

 

表1. 不同物種ACE2與SARS-CoV RBD的結(jié)合（引用Fang Li 2016）

 

與SARS-CoV和MERS-CoV一樣，SARS-CoV-2也是人畜共患病原體，可越過物種間的壁壘感染人類。病毒種間傳播的機(jī)制是一個亟需解決的重要科學(xué)問題。這些冠狀病毒的胞膜蛋白和受體識別并發(fā)生細(xì)胞融合，而Spike蛋白在與膜發(fā)生融合之前需要被宿主蛋白切割，這個過程也是病毒在感染宿主時的必經(jīng)過程，因此，若是將其阻斷，即可阻止了病毒的感染性。

 

結(jié)語

 

本文詳細(xì)表述了Spike蛋白和細(xì)胞膜受體蛋白ACE2的結(jié)構(gòu)以及作用方式，結(jié)合之前關(guān)于SARS-CoV的相關(guān)研究對SARS-CoV-2進(jìn)行分析，最終落腳到受體蛋白上的兩個結(jié)合熱點區(qū)，然而要驗證這些位點與臨床表現(xiàn)的關(guān)系，必須回到體內(nèi)進(jìn)行研究，以基因修飾小鼠模型為研究工具，進(jìn)行更精細(xì)化更貼近臨床的研究，這或許對疫苗及藥物的研發(fā)有著重要的指導(dǎo)意義。當(dāng)然，這里沒有探討同樣是冠狀病毒的MERS-CoV結(jié)合域及其受體CD26，如果感興趣，我們期待著能給研究者們帶來更多的精彩解讀。

 

病毒研究道阻且長，希望在人類與微生物的抗戰(zhàn)中，我們能走在前面，站在高處，更透徹的了解對手，人類文明因為有科學(xué)技術(shù)的不斷探索而變得更加神秘而多彩。

 

關(guān)于賽業(yè)生物

 

冠狀病毒的防治研究是個艱巨的探索過程。不論是疫苗研發(fā)、新藥篩選還是基因治療，均需要精準(zhǔn)的動物模型來驗證疾病的發(fā)病機(jī)制和免疫機(jī)制。賽業(yè)生物作為一家專業(yè)的動物模型服務(wù)商，自疫情爆發(fā)以來便緊急召集公司的研發(fā)人員全力研發(fā)與新型冠狀病毒研究相關(guān)的動物模型，期望能為疫情防治貢獻(xiàn)一份力量。眾志成城，有愛必勝，相信我們一定能打贏這場沒有硝煙的戰(zhàn)爭。

 

參考文獻(xiàn)：

1. Roujian Lu, Xiang Zhao, Juan Li, Peihua Niu, Bo Yang, Honglong Wu et al. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. The lancet. 2020.

2. Guangwen Lu, Qihui Wang, George F. Gao. Bat-to-human: spike features determing host jump of coronaviruses SARS-CoV, MERS-CoV, and beyond. Cell press. 2015.

3. Fang Li. Structure, function, and evolution of coronavirus spike proteins. Annual review of virology. 2016.

4. Yushun Wan, Jian Shang et al. Receptor recognition by novel coronavirus from Wuhan: An analysis based on decade-long structural studies of SARS. Journal of virology. 2020.

5. Fang Li et al. Structure of SARS coronavirus spike receptor-binding domain complexed with receptor. Science. 2016.