冠狀病毒科

高致病性冠狀病毒SARS-CoV和MERS-CoV最近出現(xiàn)在人類群體中，但包括HCoV-oc43、HCoV-229e、HCoV-nl63和HCoV-hku1在內(nèi)的其他人類冠狀病毒估計已在人類群體中傳播了數(shù)百年，導(dǎo)致輕度呼吸道疾病，其中約5-30%的“普通感冒”。

在冠狀病毒科（nidovirales）中，有四個屬被鑒定：alphacoronavirus，betacoronavirus，gammacoronavirus和deltacoronavirus 。
目前鑒定的幾種人HCoVs屬于alphacoronavirus（HCoV-229e和HCoV-nl63）和betacoronavirus（SARS-cov、MERS-cov、COVID-19，HCoV-OC43和HCoV-HKU1）。gammacoronavirus和deltacoronavirus沒有已知感染人類的病毒。

泛冠狀病毒藥物發(fā)現(xiàn)的體外研究系統(tǒng)

反向遺傳學(xué)系統(tǒng)

高致病性冠狀病毒和潛在泛冠狀病毒藥物候選藥物的研究進(jìn)展，部分依賴于基因操縱CoVS的技術(shù)，以探討病毒發(fā)病機制和抗病毒藥物活性。

反向遺傳學(xué)系統(tǒng)可根據(jù)已知的病毒序列合成病毒。因為傳染性病人樣本收取、分離、運送等限制了大多數(shù)實驗室對臨床分離病毒的獲取和使用。反向遺傳學(xué)系統(tǒng)為研究病毒的發(fā)病機制和模型開發(fā)提供了必要的研究材料。

在SARS大流行之前，通過系統(tǒng)地將cDNA盒組裝成全長的傳染性克隆，可以對病毒基因進(jìn)行精確和有針對性的遺傳操作，已經(jīng)開發(fā)出了強大的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)來操縱CoVs的基因組。

感染性克隆允許創(chuàng)造近同質(zhì)的病毒種群，而傳統(tǒng)的病毒種群是通過放大細(xì)胞培養(yǎng)來制備的。除了重建covs的流行株外，反向遺傳系統(tǒng)還允許將突變靶向到特定的病毒基因，獲取無傳染性的組裝病毒 。

作為一個例子，將分離特定基因突變的能力應(yīng)用于SARS-CoV的Spike(S)糖蛋白的研究，同時保持病毒復(fù)制體和其他結(jié)構(gòu)蛋白的等基因背景。將SARS-CoV暴發(fā)的人畜共患病、早期、中期和晚期流行病毒株的突變插入SARS-CoV（Urbani）流行菌株的s糖蛋白中，以確定進(jìn)化對病毒進(jìn)入人類細(xì)胞的影響，以及嚙齒動物和靈長類疾病模型中病毒的發(fā)病機制。通過將突變靶向到特定的病毒基因，反向遺傳學(xué)系統(tǒng)允許研究人員探索宿主對病毒遺傳變化的致病反應(yīng)的因果關(guān)系。此外，利用反向遺傳學(xué)技術(shù)合成大量研究用材料，對于高通量藥物篩選研究極為重要。

細(xì)胞研究系統(tǒng)

和所有其他病毒一樣，冠狀病毒需要宿主細(xì)胞機制來復(fù)制它們的基因組，產(chǎn)生后代病毒，并導(dǎo)致疾病 。
細(xì)胞株需要宿主細(xì)胞受體的表達(dá)以及必要的蛋白酶的表達(dá)，以促進(jìn)病毒的進(jìn)入。

冠狀病毒的S糖蛋白是宿主細(xì)胞附著和病毒進(jìn)入的主要決定因素，在HCoVs之間不太保守 。雖然所有已知的HCoVS都有針對人類呼吸道的病毒性取向，但還沒有建立可被廣泛HCOVS感染的肺細(xì)胞系。

SARS-CoV和MERS-CoV的一個關(guān)鍵特征是，高致病性冠狀病毒在更廣泛的細(xì)胞系中比其他輕度致病性冠狀病毒HCoV-OC43、HCoV-229e、HCoV-nl63和HCoV-hku1的病毒滴度更高。

用HCoVs和BatCoVs感染各種動物的細(xì)胞系，有助于發(fā)現(xiàn)病原體的潛在宿主范圍，并有助于識別參與病毒傳播的易感哺乳動物宿主。但也不是對應(yīng)關(guān)系，在動物體內(nèi)，受體及免疫的多樣性和可用性與單純細(xì)胞系不同。原代細(xì)胞進(jìn)行假復(fù)層氣道上皮培養(yǎng)，可以模擬動物體內(nèi)氣道上皮細(xì)胞的復(fù)雜性，但是無法捕捉到，完整免疫系統(tǒng)與病毒相互作用，包括促炎細(xì)胞的浸潤，這些細(xì)胞可能在最嚴(yán)重形式的SARS和MERS中促進(jìn)ARDS。類器官可能模擬免疫細(xì)胞和病毒的相互作用，但還沒有在冠狀病毒應(yīng)用。

泛冠狀病毒體內(nèi)研究模型

小動物模型

在2003年SARS-CoV出現(xiàn)后，通過給動物接種病人分離SARS-CoV，啟動了小動物模型的開發(fā)，包括：小鼠、倉鼠、豚鼠和雪貂，但只有雪貂表現(xiàn)出感染引起的疾病跡象。

在小鼠的實驗中，小鼠可以復(fù)制SARS-Cov，但沒有引起疾病跡象，在這些模型中，病毒從肺中迅速清除。
 
多個研究小組發(fā)現(xiàn)在小鼠肺部連續(xù)傳代，產(chǎn)生小鼠適應(yīng)性SARS-cov，在野生型小鼠鼻內(nèi)感染模型中引起致死性肺部疾病，此模型被用于藥物開發(fā)。野生型自交系小鼠的SARS-CoV適應(yīng)模型的益處包括通過個體小鼠的存活、體重減輕和全身多層攝影檢測的可復(fù)制的疾病易感性，以及浸潤細(xì)胞的定量、病毒滴度、組織病理學(xué)、轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)組學(xué)在靶器官中的變化。

為了評估體內(nèi)緊急病毒的發(fā)病機制，人畜共患SARS-cov和preemergent batcov突變已被納入SARS-CoV MA15模型，為有可能出現(xiàn)在人類體內(nèi)的病毒提供了新的動物模型。在SARS-CoV MA15模型中，研究嚴(yán)重Cov疾病的變量，其他有價值的因素包括年齡、劑量和宿主對疾病表型的遺傳貢獻(xiàn)。

用于藥物發(fā)現(xiàn)的SARS-cov小鼠適應(yīng)模型的最大局限性是將突變納入SARS-cov基因組（特別是用于測試針對具有突變的病毒基因的抗病毒藥物），以及小鼠和人類免疫反應(yīng)之間的差異。

與SARS-CoV不同的是，MERS-CoV的人類臨床病毒株沒有在小鼠、倉鼠或雪貂中復(fù)制，原因是：人類DDP4與實驗動物的關(guān)鍵氨基酸存在差異。在兔子模型中發(fā)現(xiàn)病毒復(fù)制，但是沒有臨床表現(xiàn)，所以少量藥物研究在使用。人DDP4轉(zhuǎn)基因小鼠開始被使用，類似于SARS-CoV，在小鼠肺傳代產(chǎn)生適應(yīng)性，進(jìn)而產(chǎn)生臨床表現(xiàn)。CRISPR/Cas9也被用于產(chǎn)生特定基因突變DDP4的轉(zhuǎn)基因鼠。

靈長類動物

小動物模型作為冠狀病毒感染的模型得到了更徹底的開發(fā)，這是由于嚙齒動物容易被操縱，以及與非人類靈長類動物（NHPS）相關(guān)的成本和倫理問題增加所致。然而，高致病性冠狀病毒感染的NHP模型的發(fā)展是評價泛冠狀病毒治療學(xué)的關(guān)鍵，因為來自NHPS的宿主免疫反應(yīng)與人類相比具有更大的同源性，并且可能更準(zhǔn)確地指示評估泛冠狀病毒治療所需的嚴(yán)重疾病的免疫生物標(biāo)志物。

在NHP感染模型中觀察到疾病表征與嚙齒類動物SARS-CoV和MERS-CoV模型不同。從人類中分離出的SARS-COV和MERS-CoV都在NHPS中復(fù)制，可以體現(xiàn)對冠狀病毒引起的疾病的重要方面的保護(hù)，包括呼吸道生物學(xué)、受體同源性以及宿主受體和蛋白酶的表達(dá)模式。

常見的SARS-CoV實驗室靈長類動物，包括非洲綠猴、恒河猴、獼猴和常見的狨猴，導(dǎo)致了不同程度的嚴(yán)重程度的疾病跡象，但沒有一種能反映人類所見的致死性SARS疾病，感染后急性肺組織病理學(xué)觀察到最嚴(yán)重的疾病表型（3-6天），典型表現(xiàn)為肺部病變和肺炎，偶爾觀察到彌漫性肺泡損傷�？梢詮�(fù)制部分老年加重的表型和天然免疫異常變化。

非人類靈長類動物MERS-CoV感染模型，其中最具特征的模型為恒河猴和普通狨猴的MERS-CoV感染。注射MERS-CoV病毒，引起輕癥改變，很少見可觀察的疾病變化。包括注射，口服等多種形式給病毒可以引起中等程度的改變，重癥模型在狨猴可見。但是多種途徑，就無法體現(xiàn)病毒實際感染路徑。同時缺乏可重復(fù)的臨床疾病體征，如發(fā)燒、呼吸窘迫或致命性。

泛抗冠狀病毒藥物

三類靶點
 

1. 非結(jié)構(gòu)型蛋白：3c樣蛋白酶（3CLpro）、木瓜蛋白酶（PLpro）和RNA依賴性RNA聚合酶（RdRp）。
2. 結(jié)構(gòu)性蛋白：Spike（S）糖蛋白、包膜（E）蛋白、膜（M）蛋白和核帽（N）蛋白
3. 輔助蛋白：病毒間變異太大，不是很好的藥物靶點

靶向CoV非結(jié)構(gòu)性蛋白（nonstructural proteins，nsps)

冠狀病毒NSPs是冠狀病毒生命周期中高度保守的成分，介導(dǎo)病毒復(fù)制，包括3c樣蛋白酶（3CLpro）、木瓜蛋白酶（PLpro）和RNA依賴性RNA聚合酶（RdRp）。

CoVRdRp復(fù)制病毒RNA基因組并生成病毒RNA轉(zhuǎn)錄本，這是細(xì)胞聚合酶無法實現(xiàn)的基本功能。CoV生命周期的另一個基本元素是由3CLpro和PLpro兩種病毒蛋白酶將病毒多蛋白水解成功能性的nsps。

除了聚合酶和蛋白酶功能外，CoVs的nsps還具有其他基本功能，包括免疫拮抗、雙膜囊泡組織、復(fù)制復(fù)合物、核酸結(jié)合、解旋酶活性和病毒RNA校對，這些功能可能是冠狀病毒特異性抗病毒藥物發(fā)現(xiàn)的未來靶點。

GS-5734瑞德西韋（Remdesivir）

GS-5734是一種小分子核苷類似物，靶向病毒RdRp（RNA合成酶），起到抑制病毒復(fù)制作用在體外對幾個新出現(xiàn)的傳染病的病毒家族表現(xiàn)出抗病毒活性，包括絲狀病毒科、肺炎病毒科、副粘病毒科和冠狀病毒科。

三個臨床包括兩個2019-nCov（COVID19）：
 NCT02818582（ GS-5734 to Assess the Antiviral Activity, Longer-Term Clearance of Ebola Virus, and Safety in Male Ebola Survivors With Evidence of Ebola Virus Persistence in Semen，National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID)
NCT04257656 （Severe 2019-nCoV Remdesivir RCT，Capital Medical University ，Bin Cao, China-Japan Friendship Hospital）
NCT04252664（Mild/Moderate 2019-nCoV Remdesivir RCT，Capital Medical University，Chinese Academy of Medical Sciences，Bin Cao, China-Japan Friendship Hospital）

洛匹那韋-利托那韋（(克力芝）

洛匹那韋-利托那韋最初是作為HIV-1蛋白酶抑制劑開發(fā)的，但在體外活性也針對SARS-CoV非結(jié)構(gòu)蛋白3CLpro。在SARS-CoV流行期間，SARS患者的洛匹那韋-利托那韋聯(lián)合利巴韋林治療與歷史對照病例相比，降低了病毒載量，降低了死亡或ARDS的不良臨床結(jié)果。

在MERS出現(xiàn)后不久，已知抗病毒化合物的高通量篩選方法在體外鑒定了洛匹那韋對MERS-cov的活性，口服洛匹那韋-利托那韋治療MERS-CoV狨猴模型，MERS疾病體征略有改善，包括胸部x線識別的肺浸潤減少，間質(zhì)性肺炎減少，體重減輕。病人治療有陽性結(jié)果，包括退燒，血清和痰的病毒清除，以及生存有關(guān)。根據(jù)體外和體內(nèi)對抗MERS-cov的活性，沙特阿拉伯一項臨床，住院的MERS患者中使用洛匹那韋-利托那韋和IFN-β1b聯(lián)合治療。

利巴韋林

利巴韋林是一種鳥苷類似物，對大量高致死性新興病毒具有體外活性。利巴韋林抑制病毒RdRp，抑制RNA合成，并抑制mRNA的Capping。然而，研究表明，雖然SARS-CoV、MERS-CoV和HCoV-oc43在體外對利巴韋林敏感，但顯著抑制CoV復(fù)制的劑量，超過了人類使用利巴韋林最高濃度。

在小鼠模型中對利巴韋林的體內(nèi)測試發(fā)現(xiàn)，單獨使用利巴韋林對MA15SARS-CoV的活性有限，并顯示利巴韋林治療可增強SARS疾病征象。

然而，利巴韋林和I型干擾素在靈長類動物模型中的聯(lián)合治療改善了MERS的疾病體征。病人治療，利巴韋林治療高致病性冠狀病毒呼吸綜合征患者的療效有限。

靶向cov結(jié)構(gòu)蛋白和輔助蛋白

結(jié)構(gòu)蛋白：Spike（S）糖蛋白、包膜（E）蛋白、膜（M）蛋白和核帽（N）蛋白。

S蛋白決定病毒細(xì)胞取向、宿主范圍和病毒進(jìn)入；E蛋白促進(jìn)病毒的組裝和釋放，并具有病毒素活性；M蛋白維持病毒子膜結(jié)構(gòu)；N蛋白使病毒RNA基因組化。但是研究顯示部分結(jié)構(gòu)蛋白去除，并不改變病毒復(fù)制能力。

輔助蛋白因為數(shù)量，序列，功能在病毒間差異非常大，不是很好的藥物靶點。

單抗藥物

針對S蛋白的單抗藥物研究最多，以期阻止病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞。但是病毒會通過突變，躲避抗體藥物。所以有設(shè)計單抗藥物雞尾酒以克服病毒的逃逸。也有報道，S蛋白抗體會激活病毒。

疫苗

疫苗長期以來一直被認(rèn)為是針對人類群體的預(yù)防和根除傳染病的金標(biāo)準(zhǔn)，并賦予個人長期免疫保護(hù)的好處。但是冠狀病毒是人畜共患病，針對人的疫苗也無法根除。針對中間宿主的疫苗也在開發(fā)，針對MERS-COV的駱駝中間宿主的疫苗接種策略已經(jīng)開發(fā)出來，這可能有助于抑制駱駝中的病毒復(fù)制，防止MERS-COV傳播到人類，針對sars-cov開發(fā)的疫苗制劑不僅未能保護(hù)老年人群的動物模型，而且還導(dǎo)致年輕人群的免疫病理。所以疫苗開發(fā)有很多路要走。

靶向宿主

宿主因素調(diào)節(jié)

針對病毒蛋白的小分子化合物及抗體藥物，病毒可以突變自己，來適應(yīng)，產(chǎn)生耐藥。因而，有研究想通過改變宿主細(xì)胞蛋白（尤其是和病毒生命周期密切相關(guān)的宿主蛋白），這樣可以避免病毒突變產(chǎn)生的耐藥。幾個研究組開始針對宿主蛋白酶（弗林蛋白酶，組織蛋白酶，跨膜絲氨酸蛋白酶，這些蛋白酶是病毒通過S蛋白進(jìn)入宿主所需）抑制劑。但是不同病毒通過S蛋白進(jìn)入宿主細(xì)胞所需蛋白酶有差異。環(huán)孢菌素開始進(jìn)入研究，展現(xiàn)一定效果。

宿主免疫調(diào)節(jié)

合理的利用免疫系統(tǒng)，肯定是抗病毒的最好出路。比如1型IFN被用于冠狀病毒臨床治療。因為1型干擾素是連接天然和適應(yīng)性免疫的重要橋梁。當(dāng)然在細(xì)胞因子風(fēng)暴出現(xiàn)后，抑制免疫也成為對癥治療必需做出的選擇。如何使用宿主免疫調(diào)節(jié)，也是關(guān)鍵。