切向流過(guò)濾濃縮/洗濾慢病毒樣顆粒

瀏覽次數(shù)：1355　發(fā)布日期：2020-1-21　來(lái)源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

來(lái)自美國(guó)維克森林大學(xué)和安徽師范大學(xué)的科學(xué)家們?cè)?019年的《Nucleic Acids Research》雜志上發(fā)表了題為“Delivering Cas9/sgRNA ribonucleoprotein (RNP) by lentiviral capsid-based bionanoparticles for efficient 'hit-and-run' genome editing”的文章。文中，研究人員指出CRISPR/Cas9機(jī)制的瞬時(shí)表達(dá)不僅可降低脫靶導(dǎo)致的突變風(fēng)險(xiǎn)，還可降低針對(duì)Cas9蛋白質(zhì)的潛在免疫反應(yīng)，而其新近開發(fā)的系統(tǒng)通過(guò)適體和適體結(jié)合蛋白（ABP）之間的特定相互作用，可在單個(gè)慢病毒樣顆粒（Lentivirus-Like Particle, LVLP）中包裝達(dá)100個(gè)Cas9 mRNA 拷貝，基于此，研究人員開發(fā)了一種基于慢病毒衣殼的生物納米顆粒系統(tǒng)，其可高效包裝Cas9/sgRNA核糖核蛋白（RNP）。結(jié)果顯示，用一個(gè)com 適體替代sgRNA支架的四聚體，可保留向?qū)NA的功能，com-修飾的sgRNA可通過(guò)ABP和適體以及sgRNA和Cas9蛋白質(zhì)之間的特定相互作用，將Cas9/sgRNA RNP包裝進(jìn)慢病毒樣顆粒。這些RNP生物納米顆�？稍诓煌�(xì)胞中的不同靶點(diǎn)上產(chǎn)生插入和缺失，其效率與研究人員此前報(bào)道的Cas9 mRNA LVLP相當(dāng)或更好。新系統(tǒng)反應(yīng)快速，可降低脫靶率，使其在遞送Cas9 RNP用于瞬時(shí)Cas9表達(dá)和有效基因編輯時(shí)更方便、高效。

實(shí)驗(yàn)中，研究人員使用HEK 293T細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)Cas9 RNP LVLP。培養(yǎng)結(jié)束后，使用KrosFlo^®Research 2i 切向流過(guò)濾系統(tǒng)，以濃縮-洗濾-濃縮模式濃縮含有LVLP的上清液，簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，150-300mL 上清液先濃縮至~50mL，以500-1000mL PBS洗濾，最后濃縮至~8mL。中空纖維組件材質(zhì)為mPES（改性聚醚砜），MWCO為500kD。D02-E500-05-N組件的流速和壓力維持為80ml/min和8psi，C02-E500-05-N的流速和壓力維持為10ml/min和5psi。

原文：P.Lyu, P.Javidi-Parsijani, A.Atala, et al., Delivering Cas9/sgRNA ribonucleoprotein (RNP) by lentiviral capsid-based bionanoparticles for efficient 'hit-and-run' genome editing. Nucleic Acids Research, 2019, doi:10.1093/nar/gkz605.