NTA可以用來

   外泌體定量嗎？

希爾博士的意見是：

NTA可以提供樣本中顆粒的粒徑分布和絕對濃度，但不能夠以NTA所提供的濃度數(shù)值這個單一的指標來定量外泌體。

首先，我們必須理解NTA檢測原理：該技術基于布朗運動，通過視頻分析顆粒計數(shù)，可同時獲取樣本中顆粒的粒徑和絕對濃度。

因此，樣本中的所有顆粒，都會被偵測并計入，而不能篩選出外泌體單獨進行計數(shù)；同理：也不能通過NTA所提供的粒徑分布情況這個單一的指標判斷所提取出的內容物就是外泌體；例如下圖為常見的粒徑濃度分布圖，可以說明所提取的內容物是在外泌體粒徑范圍內，但是否為外泌體還需要結合其他方法綜合驗證，譬如：透射電鏡、western blot等。

某外泌體樣本的粒徑-濃度分布圖（檢測方法：NTA）
那到底怎樣可以定量外泌體呢？
我們來看一下國際胞外囊泡協(xié)會（ISEV)新發(fā)布的Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018（簡稱MISEV 2018)是如何說的：

EVs have a particulate structure and contain proteins, lipids, nucleic acids, and other biomolecules. Quantification of each of these components can be used as a proxy for quantification of EVs, but none of these values is necessarily perfectly correlated with EV number.

這段話是說：EVs（extracellular vesicles）有其獨特的結構和內含物（蛋白、脂質體、核酸和其他生物分子）。用其中任意一個指標來定量EVs都是可以接受的，但也沒有任何一個值能確切反映EV的數(shù)量。

所以，目前沒有完美的外泌體定量方法。
當然，正如MISEV2018所述，大家還是可以基于EVs獨特的結構和內含物來進行定量：

顆粒數(shù)

利用NTA、FCW、TRPS、SPR等都可以用于顆粒計數(shù)，不同平臺得到的數(shù)值會有差異。

當然，以顆粒數(shù)來定量外泌體，通常都會高估，因為如果外泌體樣本中存在脂蛋白、蛋白團聚等，這些雜質也會被一起計入。熒光模式下的NTA檢測可以實現(xiàn)檢測特定亞群的EVs，前提是對EVs的特殊表達蛋白進行熒光標記。

總蛋白量

可用比色法（Bradfold或BCA）、熒光法或直接在SDS-PAGE染色檢測總蛋白量。由于容易存在其他蛋白的污染，這個方法同樣容易高估囊泡數(shù)量。另外，是否使用detergent也會對結果有影響，因此如使用detergent，需要指明種類和使用濃度。

總脂質量

此方法利用親脂性熒光染劑（譬如：DiR）等檢測，但需要考慮背景值里其他脂質成分的干擾。

總RNA量

不是很推薦的方法，因為如有核糖體蛋白或脂蛋白也會影響檢測的數(shù)值。

EVs特殊標記物定量

此方法基于特異性表達蛋白（例如：CD9、CD81或CD63等），使用ELISA、時間分辨熒光免疫分析法（TRIFic CD9/81/63 Exosome Assay， Cell Guidance Systems）、FCW或納米管比色法定量特定亞群的外泌體數(shù)量。

上述各方法都不完美，因此實際上，外泌體的研究過程中，經(jīng)常需要結合不同定量數(shù)據(jù)作為純度的參照，例如蛋白/顆粒比、蛋白/脂質比或蛋白/RNA比等。