基因治療是目前生物醫(yī)藥領(lǐng)域最熱門的話題之一，生物醫(yī)藥行業(yè)對基因治療持續(xù)高漲的熱情，令該領(lǐng)域許多公司開始將一次治愈性基因療法，作為其開發(fā)的戰(zhàn)略核心。
 

   有行業(yè)報告顯示，未來預計 6 年內(nèi)，將有多達 60 種基因療法獲得批準，這些基因療法在 2024 年的銷售額將達到 146 億美元。

   基因治療的核心是基因載體，病毒載體占據(jù)著絕對主導地位。目前腺相關(guān)病毒（AAV）和慢病毒（LV）是臨床上最廣泛使用的病毒載體。
 

   從 2012 年荷蘭 UniQure 公司的，世界上第一 AAV 基因治療藥物 Glybera 在歐盟獲上市，到 2016 年 GSK 與意大利 San Raffaele Telethon 合作開發(fā)的 LV 基因治療藥物 Strimvelis 再次在歐盟獲批，再到 2017 年諾華獲得 FDA 腫瘤藥物咨詢委員會以 10:0 的投票結(jié)果，一致批準的自體回輸 CAR-T 細胞療，及同年 Spark Therapeutics 公司獲 FDA 批準的第一個傳疾病的基因治療藥物 Luxturna，AAV 和 LV 越來越成為基因治療的主角。AAV 和 LV 大都采用質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染方法生產(chǎn)，從而高質(zhì)量、高純度的質(zhì)粒是制 AAV、LV 等病毒載體的前提條件。

  質(zhì)粒是常見的分子生物學工具，是一段 DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)。而抽提質(zhì)粒幾乎是分子生物學基礎(chǔ)實驗之一。
 

  科研水平的實驗，通常的質(zhì)粒抽提試劑盒就足以滿足微克至數(shù)毫克級的需求，但是如果需要大規(guī)模制備病毒載體，試劑盒的質(zhì)粒產(chǎn)量就非常的力不從心了。

  此外，包裝病毒通常需要三個質(zhì)�；蛩膫�質(zhì)粒，每個質(zhì)粒大小、序列都不一樣，上游表達量也有區(qū)別，甚至穩(wěn)定性都有差異。
 

   面對如此眾多品種的質(zhì)粒，有沒有一種質(zhì)粒 DNA 純化平臺，能夠適用多種質(zhì)粒的、可放大的，滿足基因治療、細胞治療和疫苗的高純度和同質(zhì)性的標準要求，并且還需要有效，穩(wěn)健和可擴展的下游過程呢?


 

   接下來為大家隆重介紹 BIA Separations 提供的，基于對流相互作用介質(zhì)（CIM）層析整體柱的兩步質(zhì)粒 DNA（pDNA）純化平臺！

   該方法除了具有以上全部優(yōu)點，并且可以明顯降低純化時間，提高生產(chǎn)效率，使其成為 GMP 環(huán)境下的大規(guī)模 pDNA 純化的選擇。

   該方法專為純化大分子和納米顆粒的整體柱而設(shè)計，可實現(xiàn)快速操作，高流量，同時提供動態(tài)結(jié)合能力和分辨率。

 

首先要為整個過程中的核心——兩步層析步驟，準備細菌培養(yǎng)液
 

1. 大腸桿菌收獲、裂解－堿裂解：
 

這是快速高效純化質(zhì)粒 DNA 亞型的基礎(chǔ)。
 

操作建議：
 

  先收集菌體；
  然后采用堿性裂解法制備原料；

  再將細菌細胞（通常是細胞生物質(zhì)或細胞沉淀）懸浮在 50 mMTris-HCl，10 mM EDTA，pH8.0 中；

  通過加入等體積的 0.1-0.4M NaOH，1%SDS 進行裂解。
 

2. 裂解液濃縮：
 

氯化鈣沉淀后澄清，除去了大量的主要樣品雜質(zhì)

​​​​​​​   裂解后，懸浮液變粘稠，通過加入與懸浮緩沖液等體積的，4-8℃ 冷卻的 3M CH 3 COOK（pH 5.5）沉淀細胞碎片和 SDS 復合物。

​​​​​​​   在溫和混合下，緩慢加入 CaCl2 并孵育 15 分鐘。
 

TIPS:
 

1. 氯化鈣用作沉淀劑，以去除 RNA、基因組 DNA 和其他雜質(zhì);

2. 較高濃度的雜質(zhì)需要 CaCl2 濃度高達 1M;

3. 考慮測試多種濃度并評估產(chǎn)品中雜質(zhì)的有效去除和未受影響的 pDNA 產(chǎn)量;

4. 加入速度應(yīng)該很慢，以防止局部溫度上升;

5. 孵育后，進行一系列澄清步驟，從離心或粗過濾開始，例如 80μm 深度過濾，并以 1-5μm 過濾結(jié)束。

（低溫有利于沉淀，混合過程應(yīng)該溫和操作，以防止 DNA 降解。）

 

 

前面 blabla 說了那么多，然而純化才是本工藝的精華所在。
 

BIA Separations 的二步純化工藝的穩(wěn)健性、連貫性、時效性，均堪稱教科書式的經(jīng)典。
 

第一步純化的柱子，通過弱陰離子交換，濃縮 pDNA 并去除大部分 HCP、mRNA 和基因組 DNA；
 

第二步利用疏水相互作用色譜（HIC）的拋光步驟，進一步從超螺旋（SC）治療級 pDNA 中除去開環(huán)（OC）和線性 pDNA 亞型。
 

兩步純化的作用功能明確、互相合作，大大節(jié)省操作步驟和時間。

 

​​​​​​​   AEX 色譜柱（CIMmultus™DEAE）濃縮 pDNA，并去除大部分 HCP、mRNA 和基因組 DNA。

​​​​​​​   在弱陰離子交換柱上捕獲質(zhì)粒 DNA，其中除去剩余的 RNA 和蛋白質(zhì)，樣品結(jié)合需要低電導率，通過稀釋實現(xiàn)。 

​​​​​​​   隨著增加 NaCl 的梯度洗脫，首先洗脫 RNA，然后洗脫質(zhì)粒 DNA。

 

層析條件
 

Monolithic column:	CIMmultus™  DEAE(2 µm)*1
Mobile phase:	Equilibration  buffer A1: 50 mM Tris, 10 mM EDTA,   pH 7.2
	Washing buffer  A2: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 0.6 M   NaCl, pH 7.2
	Elution buffer  A3: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 1 M   NaCl, pH 7.2
Working flow rates:	0.5 – 5 column volume (CV) /min (具體取決于樣品特性，使用的層析設(shè)備和色譜柱尺寸)

*1 選擇色譜柱體積，取決于需要處理的樣品量。
 

層析方法
 

1.  用去離子水稀釋細菌裂解物至電導率為 35-40mS / cm。稀釋取決于樣品制備過程中添加的 CaCl2 濃度。

2.  將稀釋的樣品用 0.45μm 過濾器進行過濾。

3.  將 20CV 的緩沖液 A1 平衡 DEAE 柱。

4.  將澄清的稀釋細菌裂解液進行上樣。

5.  用 20 CV 的緩沖液 A1 對色譜柱進行流洗。

6.  用 20 CV 的緩沖液 A2 對色譜柱進行流洗。

7.  用 20 CV 的緩沖液 A3（以半工作流速）洗脫并收集 pDNA。

圖 1：AEX CIMmultus™DEAE（2μm）柱上的質(zhì)粒 DNA 洗脫曲線

 

​​​​​​​    在高配體密度丁基修飾的（CIMmultus TM C4 HLD）整體柱上，利用疏水相互作用色譜柱（HIC）的拋光步驟，進一步從        超螺旋（SC）治療級 pDNA 中除去開環(huán)（OC）和線性 pDNA 亞型。

​​​​​​​ ​​​​​​​   為了富集質(zhì)粒 DNA 的超螺旋亞型，將 DEAE 洗脫液上樣到高配體密度丁基柱（C4 HLD）上。 

​​​​​​​ ​​​​​​​   該步驟進一步去除了雜質(zhì)。

 

層析條件

 

Monolithic  column:	CIMmultus™ C4  HLD (2 µm)*2
Mobile phase:	Equilibration  buffer B0:   50 mM Tris, 10 mM EDTA, 3 M   (NH4)2SO4, pH 7.2
	Washing  buffer  B1: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 1.7  M (NH4)2SO4, pH 7.2
	Adjustment  buffer: 4 M (NH4)2SO4
	Elution  buffer  B2: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 0.4  M (NH4)2SO4 , pH 7.2
	Regeneration  buffer A1: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 7.2
Working flow  rates:	0.5 – 5 CV/min (具體取決于樣品特性、使用的層析設(shè)備和色譜柱尺寸)

*2 選擇色譜柱體積，取決于需要處理的樣品量。
 

層析方法

 

1.  調(diào)節(jié)來自 DEAE 柱的含 pDNA 洗脫液，每 1 體積（V）洗脫液加入 3 體積（V）的 4M(NH4)2SO4。

2.  用 20CV 的緩沖液 B0 來平衡 C4 HLD 柱。

3.  將 DEAE 柱洗脫的 pDNA 組份上樣。

4.  用 20 CV 的緩沖液 B1 流洗色譜柱。

5.  用緩沖液 B2（以半工作流速）洗脫并收集 pDNA。

6.  用 30 CV 的緩沖液 A1 再生色譜柱。

7.  加樣 3 次后，對柱子進行清洗。

圖 2：在 HIC CIMmultus TM C4 HLD（2μm）柱上分離超螺旋質(zhì)粒 DNA

 

·  從 C4 HLD 柱洗脫的超螺旋 pDNA 組份含有硫酸銨，必須在生物應(yīng)用質(zhì)粒之前將其除去。

·  緩沖液交換可通過透析濾過或體積排除色譜等方法進行。

·  配置和填充可能需要額外的處理。
 

二步法層析過程分析：

 

​​​​​​​    質(zhì)粒 DNA 制造成功的關(guān)鍵是實時過程控制方法，確保最終產(chǎn)品中高百分比的超螺旋 pDNA。 

​​​​​​​​​​   CIMac™pDNA 分析柱可用于監(jiān)測降解產(chǎn)物（開環(huán)和線性 pDNA），去除雜質(zhì)（RNA），并確保每個生產(chǎn)步驟都能產(chǎn)生預期的超螺旋 pDNA 量。

​​​​​​​   ​​​​​​​CIMac™pDNA 分析柱還用于超螺旋質(zhì)粒 DNA 含量的質(zhì)量控制。

圖 3：使用 CIMac™pDNA-0.3 分析柱的質(zhì)粒 DNA 亞型含量的質(zhì)量控制

 

結(jié)果和結(jié)論：
 

​​​​​​​ ​​​​​  通過優(yōu)化裂解、沉淀和兩種色譜步驟相結(jié)合，可生產(chǎn)滿足所有監(jiān)管要求的純 pDNA。

​​​​​​​ ​​​​​​​  可以完成去除 99% 以上的主要雜質(zhì)（RNA，基因組 DNA，宿主細胞蛋白，內(nèi)毒素和開環(huán) pDNA）。

​​​​​​​ ​​​​​​​  此外，快速（大腸桿菌的 pDNA 提取和純化可在幾小時內(nèi)完成），可重復的過程可降低運營成本并提高工廠生產(chǎn)率。 

​​​​​​​ ​​​​​​​  獨特的整體特性有助于該過程的直接可擴展性，涵蓋從小規(guī)模實驗室到大規(guī)模工業(yè)純化 pDNA 的生產(chǎn)水平。

Table 1: Process results.

Process  yield	>  80 %
A260/280	1.92
Homogeneity  (SC pDNA)	>  97 %
HCD  – removed	>  99.5 %
HCP  - removed	>  99 %
Endotoxin	<  2 EU/mg pDNA
RNA  - removed	>  99 %

 

點評 
 

目前市面上有不少質(zhì)粒純化工藝方案，但是比較下來，BIA 二步法純化工藝具有兩大優(yōu)勢：
 

​​​​​​​  效率明顯提高

只需兩步色譜和高流速的整體柱色譜方案，減少工藝步驟（提高回收率）并加快純化速度，從而顯著提高生產(chǎn)率。
 

​​​​​​​   靈活放大

由于特定的整體柱設(shè)計，質(zhì)粒 DNA 過程可以快速擴展到更大的單位。 

在 1 毫升色譜柱上設(shè)計的工藝可以輕松轉(zhuǎn)移到試驗和生產(chǎn)規(guī)模。

在 8L 色譜柱上單次運行可以產(chǎn)生 48 g 藥物級 scDNA。
 

Table 2: Scale up options.

Column size	pDNA  purified per cycle
1  mL	6  mg
8  mL	48  mg
80  mL	480  mg
800  ml	4.8  g
8000  mL	48  g

 

十多年來，BIA Separations 一直是高效率質(zhì)粒純化的好選擇。它不僅提供整體柱和平臺模板，還提供定制的純化服務(wù)，以完全滿足您的質(zhì)粒 DNA 純化需求。

 

進一步閱讀：
 

應(yīng)用簡報：In-Process Control of pDNAProduction on CIMac™ pDNA Analytical Column

Jochen Urthaler, Robert Schlegl, Ales Podgornik, Ales Strancar, Alois Jungbauer, Roman Necina,

Application of monolithsfor plasmid DNA purification: Development and transfer to production, Journal of Chromatography A, Volume 1065, Issue 1, 2005, Pages 93-106, ISSN 0021-9673,