如何獲得精準的Western Blot實驗結(jié)果
如何做出一手漂亮的Western Blot實驗結(jié)果
蛋白質(zhì)免疫印跡雜交實驗（Western Blotting）是成熟 mRNA 翻譯指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成量分析檢測手段中最經(jīng)典和最廣泛為業(yè)界認可的一種,也是論文中最常見的數(shù)據(jù)呈現(xiàn)形式之一。雖然Western Blot實驗原理比較簡單，但是實驗耗時長、步驟繁瑣和實驗結(jié)果重復(fù)性差，導(dǎo)致剛進實驗室的小伙伴們，實驗做的焦頭爛額。
那么如何做出一手漂亮的Western Blot實驗結(jié)果呢，請小伙伴們跟隨星博士的腳步，了解Western Blot實驗的相關(guān)知識，let's go！
Western Blotting實驗原理：
蛋白質(zhì)印跡法（免疫印跡試驗）即Western Blot，簡稱WB。其基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行著色，將電泳分離后的細胞或組織總蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物（NC膜或PVDF膜）上，然后用特異性抗體檢測某特定抗原的一種蛋白質(zhì)檢測技術(shù)。
Western Blotting實驗步驟：
- 樣品制備
樣本制備是決定蛋白質(zhì)免疫印跡是否成功的關(guān)鍵步驟之一。樣本必須進行研磨、勻漿、超聲處理。膜蛋白需用更劇烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還需要注意的一點就是組織中的蛋白酶活性更強，需要加入PMSF抑制酶的活性。思科捷為大家提供強、中、弱三種RIPA裂解液，以及適用于各種類型的蛋白酶抑制劑。
- 電泳分離
準備好樣品后，第二步就是上樣和電泳分離了，上樣之前小伙伴們要做的必要步驟是確定蛋白質(zhì)濃度，根據(jù)蛋白質(zhì)濃度確定上樣量。星博士給大家推薦BCA和Bradford兩款蛋白濃度測定試劑盒，小伙伴們可以根據(jù)自己的實驗需求自行選擇。
測完了蛋白質(zhì)濃度，接下來就是上樣了。首先要制備凝膠，選用SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（EC0003），簡單省時。然后安裝電泳槽，將膠片安置在電泳槽中，在電泳裝置中加入SDS-PAGE電泳液。思科捷提供10×的電泳液，稀釋后直接使用，方便快捷。
上樣結(jié)束后，設(shè)置電泳程序一般濃縮膠80V，分離膠120V，電泳時間一般為1-2小時，根據(jù)溴酚藍指示位置選擇停止電泳時間即可。
- 轉(zhuǎn)膜
針對特定分子量大小靶蛋白而選擇適當轉(zhuǎn)膜條件（轉(zhuǎn)膜時間，轉(zhuǎn)膜緩沖液和必要低溫環(huán)境）能夠?qū)?SDS-PAGE 膠上蛋白樣品盡可能完全轉(zhuǎn)移到印跡膜上，同時減少蛋白不必要的降解，這對于最終獲得清晰、可信結(jié)果也是需要考慮因素。轉(zhuǎn)膜方式主要包括濕式電印跡法（最佳轉(zhuǎn)膜方法）、半干式電印跡（可選的替代轉(zhuǎn)膜方法）以及干式電印跡（有限靈敏度的轉(zhuǎn)膜方法）。根據(jù)實驗室習慣和需求，小伙伴們可以自行選擇轉(zhuǎn)膜方式。
膜的選擇
膜的選擇主要從實驗?zāi)康暮蛯嶒炓髞砜紤]，例如做分子量小于20kDa的小蛋白，0.45um的膜是不可取的，因為可能會使得蛋白因透過膜孔而造成膜結(jié)合的目的蛋白含量不確定，從而影響最終結(jié)果的可靠性。通常小于20KDa的蛋白選擇0.2um的膜，而大于20KDa的蛋白選擇0.45um的膜。常見的膜有NC膜和PVDF膜，區(qū)別如下：
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NC膜 |
PVDF膜 |
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靈敏度和分辨率 |
高 |
高 |
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背景 |
低 |
較高 |
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結(jié)合能力 |
80-110ug/cm2 |
125-200ug/cm2 |
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材料質(zhì)地 |
干的NC膜易脆 |
機械強度高 |
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溶劑耐受性 |
無 |
有 |
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操作程序 |
緩沖液潤濕，避免氣泡 |
使用前100%甲醇潤濕 |
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檢測方式 |
ECL檢測 |
ECL檢測 |
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價格 |
較便宜 |
較貴 |
轉(zhuǎn)膜方式的選擇
濕轉(zhuǎn)：
通常我們在做濕轉(zhuǎn)的時候，選擇100V恒壓（高強度，因為低強度時間較長，且效率較低），電流控制在120-350mA之間，分子量在60KD以下的60分鐘即可，分子量在60KD以上的需要延長轉(zhuǎn)膜時間60-150分鐘才能確保高效率的轉(zhuǎn)膜。所以如果你所研究的兩個蛋白分子量差異比較大（如GAPDH 37KD，Ki67 358KD），你可以考慮將膠從中間分開，兩部分分別采用不同時間轉(zhuǎn)印，能達到你理想的效果。電轉(zhuǎn)液一般可以重復(fù)使用3次，之后電流會過大，不適合再使用。
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濕轉(zhuǎn) | |
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優(yōu)點 |
缺點 |
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轉(zhuǎn)膜條件靈活容易進行調(diào)整 |
Buffer加熱可能干擾轉(zhuǎn)印 |
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多種Buffer可用于優(yōu)化轉(zhuǎn)印 |
在轉(zhuǎn)印的時候需要制冷裝置 |
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可以延長轉(zhuǎn)印時間 |
需要大量的轉(zhuǎn)膜緩沖液 |
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可用于定量Western Blot |
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半干轉(zhuǎn)：
對于半干轉(zhuǎn)來說，也需要進行堆疊組裝（濾紙，膠，膜需要放在轉(zhuǎn)印buffer中進行預(yù)平衡）放在裝置電極板的底部，蓋上上極板，高強的電流通過三明治結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)印速度較快，一般小于1h。
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半干轉(zhuǎn) | |
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優(yōu)點 |
缺點 |
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轉(zhuǎn)膜速度快 |
低分子量蛋白容易轉(zhuǎn)過 |
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用不連續(xù)的Buffer系統(tǒng)優(yōu)化轉(zhuǎn)印的蛋白 |
對于分子量＞120KDa的蛋白，轉(zhuǎn)印較困難 |
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轉(zhuǎn)膜緩沖液用量少 |
轉(zhuǎn)膜過程容易干膠 |
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容易安裝 |
對于定量的Western實驗不推薦使用 |
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對于同一蛋白的多張膜的分析比較有益 |
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需要注意的是：低溫對于膜的轉(zhuǎn)印是至關(guān)重要的，尤其是在轉(zhuǎn)印時間較長而無人監(jiān)管的情況下。針對剛建的實驗室平臺或者一些新蛋白的研究，經(jīng)過轉(zhuǎn)印的膠和膜都要通過染色確定轉(zhuǎn)膜效率（膠用考馬斯亮藍加熱染色，膜用麗春紅染色，均只需幾分鐘，并不耽誤太多時間），不然后面的實驗既費時也費抗體。
- 封閉
在做Western blot實驗中，因固相載體(如NC膜，PVDF膜)表面有很多孔，通過電轉(zhuǎn)，膠上的蛋白被轉(zhuǎn)移到膜上，蛋白以機械填補(堆積)和吸附的方式結(jié)合于表面。蛋白塞進了表面孔里面，但是蛋白并不是連續(xù)的，而有很多空隙，抗體也是蛋白，也會被吸附在空的洞里，這樣就會有很多非特異性的信號。
因為有“填補”和“覆蓋”蛋白結(jié)合位點以避免一抗的非特異性結(jié)合，所以有“封閉”的說法。星博士在此介紹常見封閉液的一些特點，有助于大家選擇：
常見的封閉液——BSA
BSA是最常用的封閉液，成分單一適用于大多數(shù)情況。若免疫原是偶聯(lián)BSA的，BSA有很強的免疫原性，會導(dǎo)致產(chǎn)生很多針對BSA的抗體，為避免交叉反應(yīng)，不能用BSA，脫脂奶粉封閉，可以選用酪蛋白或無蛋白的封閉液。
常見的封閉液——脫脂奶粉
脫脂奶粉最大的優(yōu)點是價格便宜，但由于成分相對復(fù)雜，所以適用范圍要狹窄一些。針對磷酸化蛋白的檢測不能用脫脂奶粉，脫脂奶粉含有酪蛋白，該蛋白本身就是一種磷酸化蛋白，使用會造成高背景磷酸化抗體也許會導(dǎo)致背景增加，此外，因為自身含有生物素，不能用于生物素標記的抗體系統(tǒng)。
封閉體系并不是一成不變的，不同的封閉體系往往會得到不一樣的實驗結(jié)果，由此可見，做Western Blot實驗中，封閉液的選擇也是需要謹慎的。
不同封閉體系結(jié)果的差異
- 抗體孵育
一抗一般按照說明書進行稀釋后，室溫孵育1-2h，或者4℃過夜。為了讓抗體充分與蛋白結(jié)合，大多數(shù)實驗室一般會選擇4℃過夜。一抗孵育結(jié)束后TBST洗滌三次，用稀釋后的二抗，室溫孵育1-3小時，TBST洗滌三次。
抗體是決定Western Blot實驗成敗的最關(guān)鍵因素，選擇具有一定文獻引用數(shù)的品牌不僅更容易得到清晰可信的結(jié)果同時更能夠得到同行認可，針對一些表達峰度高且穩(wěn)定的蛋白可以選擇國產(chǎn)化抗體，既能保證實驗結(jié)果準確性又可降低實驗成本，抗體的保存往往也是大家最容易忽略的一個環(huán)節(jié)，而因抗體保存不當造成實驗失敗的例子比比皆是。
保存溫度和條件（僅供參考）
對于很多抗體而言，分裝成小等份并凍存于-20℃或-80℃是最佳保存條件。分裝成小等份可最大程度減少由凍融造成的抗體效價降低，以及從單個試劑瓶中多次吸取而引入的污染。小等份只需凍融一次，如有剩余，可將剩余物保存于4℃，建議一周內(nèi)用完。在收到抗體時，在10000×g下離心20秒以沉積截留于試劑瓶螺紋的溶液，并以小等份轉(zhuǎn)移至低蛋白結(jié)合微量離心管中。小等份的量取決于實驗人員在實驗中通常采用的量。小等份應(yīng)不小于10μl；等份越小，儲液濃度因抗體蒸發(fā)及吸附于保存瓶表面而受到的影響越大。
在大多數(shù)情況下，收到抗體時在4℃下保存一至兩周，然后再冷凍進行長期保存是可以接受的，但也許腹水液是例外，它可能包含蛋白酶，因而應(yīng)該盡快凍存。不同品牌的抗體保存方式往往不同，具體保存方式需參考產(chǎn)品說明書。
- 檢測
抗體孵育完，就到了Western Blot實驗的最后一步——檢測了。
目前最常用的檢測方法是ECL化學發(fā)光法，主要針對HRP標記的二抗。思科捷為大家提供極超敏和超敏兩種ECL發(fā)光液供大家選擇。一款合適的發(fā)光液能使你的Western Blot圖片更加美觀。
Western Blot的基礎(chǔ)部分就先講到這里，歡迎小伙伴們在評論區(qū)留言，針對Western Blot實驗的問題，星博士將一一為大家解答。
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