近年來，生物藥的市場需求逐年擴容，其中抗體藥物因其靶向性好，治療效果顯著，在生物藥中占據(jù)著舉足輕重的地位，目前已經(jīng)進入了抗體藥物發(fā)展的黃金時代。隨著抗體藥的需求越來越大，抗體篩選技術(shù)的發(fā)展也是日新月異，目前應用較普遍的有雜交瘤技術(shù)、抗體文庫篩選技術(shù)、納米抗體技術(shù)和轉(zhuǎn)基因小鼠抗體篩選技術(shù)。其中抗體文庫篩選又分為噬菌體展示篩選技術(shù)、酵母表面展示技術(shù)、核糖體展示技術(shù)和mRNA展示篩選技術(shù)。接下來，小編帶大家一起來了解一下這些抗體篩選技術(shù)。

雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體

 

1975年，Kohler和Milstein發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細胞和綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞進行融合，形成的雜交細胞既可產(chǎn)生抗體，又可無限增殖，從而創(chuàng)立了單克隆抗體雜交瘤技術(shù)。這一技術(shù)上的突破不僅為醫(yī)學與生物學基礎研究開創(chuàng)了新紀元，也為臨床疾病的診斷、預防和治療提供了新的方法。單克隆抗體，是由單一B細胞產(chǎn)生的高度均一、識別特定抗原表位的抗體。

 

Fig1 單克隆抗體制備^[1]

 

許多治療性單克隆抗體已廣泛用于腫瘤、自身免疫和感染等疾病的治療^[2]，單克隆抗體在臨床疾病的診斷和治療中發(fā)揮重要作用，其主要的作用機理如圖2所示^[3]，基于單克隆抗體的抗體藥是目前治療多種疾病的有效方法。

 

 

Fig2 單克隆抗體的分類及作用機理

 

噬菌體展示篩選技術(shù)

 

2018年10月3日George Smith教授因其在噬菌體展示相關(guān)研究方面的貢獻獲得了諾貝爾化學獎，近年來，噬菌體展示技術(shù)正被廣泛用于抗體藥物的研發(fā)，已有大量的上市藥物被批準使用，其原理為將B淋巴細胞的抗體重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）采用PCR方法進行擴增，將擴增的片段插入到噬菌體載體中，抗體分子Fab片段或者單鏈抗體（scFv）與單鏈噬菌體外殼蛋白以融合蛋白的形式展示在噬菌體表面，再將噬菌體轉(zhuǎn)染至宿主細胞中進行增殖，待成熟后釋放出來，最后利用抗原篩選的方法經(jīng)過親和吸附-洗脫-擴增等步驟后即可獲得靶抗原特異性的單克隆噬菌體抗體^[4]。

 

 

Fig3 噬菌體展示技術(shù)

 

酵母表面展示技術(shù)

 

酵母表面展示技術(shù)原理為將外源蛋白基因與特定的載體基因融合后導入酵母細胞，融合蛋白含有可錨定在酵母細胞壁上的結(jié)構(gòu)，經(jīng)轉(zhuǎn)錄翻譯后可將外源蛋白固定化表達在酵母細胞表面，圖4顯示為采用酵母細胞表面展示技術(shù)結(jié)合流式細胞術(shù)篩選抗體。酵母表面展示技術(shù)作為真核展示系統(tǒng)，已逐漸成為現(xiàn)代生命科學領(lǐng)域一種十分有效的展示技術(shù)，在許多方面得到了廣泛的應用^[5]。

 

Fig4酵母細胞表面展示技術(shù)^[6]

 

核糖體展示與mRNA展示篩選技術(shù)

 

1997年，Pluckthun實驗室建立了體外篩選完整功能蛋白的新技術(shù)-核糖體展示技術(shù)，其主要流程為，首先構(gòu)建核糖體展示的DNA模板，然后依次體外轉(zhuǎn)錄、體外翻譯和親和篩選。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA不含任何終止密碼，在體外翻譯過程中核糖體會停留在mRNA的3'末端，使目的基因的翻譯產(chǎn)物展示在核糖體表面，并形成mRNA-蛋白質(zhì)-核糖體”三元復合體, 采用洗脫緩沖液使核糖體解離，釋放mRNA，后者經(jīng)過純化后用作RT-PCR的模板，重新引入核糖體展示的各種必需元件、進行下一循環(huán)的富集和選擇，最終篩選出高親和力的目標分子^[7]。核糖體展示技術(shù)在細胞外進行，可獲得大容量庫（10¹¹-10¹³），篩選周期短，操作簡單，結(jié)合體外突變技術(shù)可篩選出新功能的高活性蛋白^[8]。

mRNA展示技術(shù)又稱mRNA-蛋白質(zhì)融合體展示技術(shù)，是一種新興的體外多肽篩選技術(shù)，其與核糖體展示技術(shù)原理類似，小編這里就不作贅述了。目前，mRNA展示技術(shù)已經(jīng)相當成熟，成為體外蛋白質(zhì)篩選和定向進化的有力工具，在生物技術(shù)、醫(yī)藥衛(wèi)生和蛋白質(zhì)組學等多個方面有很好的應用前景。

 

 

Fig5 核糖體展示篩選技術(shù)^[9]

 

納米抗體（Nanobody, Nb）篩選方法

 

納米抗體的制備是從駱駝體內(nèi)分離出重鏈抗體(Heavy chain antibodies , HCAbs)。提取總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得模板，根據(jù)重鏈抗體保守區(qū)域設計引物，經(jīng)PCR法擴增獲得全套重鏈抗體可變區(qū)基因(Viriable domain ofheavy chain of heavy-chain antibody, VHH)，而后將其克隆至載體，體外表達獲得含有多種單價 Nb的抗體庫。應用特定抗原從Nb庫中經(jīng)過多次淘選即可得到抗原特異性的Nb。Nb庫的構(gòu)建較為簡單、有效、僅用一對簡并引物擴增就可以獲得駱駝重鏈抗體的全套VHH基因，經(jīng)過3-4輪富集篩選后即可分析單個克隆以獲得目的抗體。Nb源于天然缺失輕鏈的重鏈抗體，天然存在，穩(wěn)定性和可溶性更強；且具有很強的抗原結(jié)合能力，特異性較強^[10]。

 

 

Fig6 納米抗體篩選方法

 

轉(zhuǎn)基因小鼠全人源抗體篩選技術(shù)

 

20世紀90年代中期以后，利用人抗體轉(zhuǎn)基因小鼠平臺技術(shù)和抗體庫平臺技術(shù)開發(fā)的全人源抗體逐漸占據(jù)了抗體藥物研發(fā)的主導地位，使抗體工程技術(shù)進入了一個新的發(fā)展階段-全人源抗體階段。轉(zhuǎn)基因小鼠制備全人源抗體的實驗原理是:采用基因編輯技術(shù)將小鼠Ig基因替換為人Ig基因，然后用抗原免疫小鼠，再經(jīng)雜交瘤技術(shù)即可大量生產(chǎn)人源化抗體。轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)平臺已經(jīng)成功地作為一個創(chuàng)新全人源單抗藥物以及常用靶點升級抗體藥物的來源。轉(zhuǎn)基因小鼠的研發(fā)周期長，風險高，但其對抗體藥物篩選的意義是巨大的，因此對其進行深入研究是非常有前景的，同時也是必要的^[11]。

好了，小編就給大家介紹到這里了，如果有興趣，歡迎與我們共同探討。

依托于基因編輯，海門動物中心和藥理藥效服務平臺，百奧賽圖于2016年正式成立新藥研發(fā)服務平臺，同時，通過將小鼠重鏈和k輕鏈基因原位置換為人抗體基因（Mb級），百奧賽圖于2019年初成功制備了全新小鼠研究模型-RenMab Mouse，通過它，我們可以直接在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生全人單克隆抗體，大大節(jié)省了鼠源抗體的改造時間，如有興趣，歡迎隨時咨詢偶~

參考資料

[1]http://www.biomart.cn/specials/cloudclone2017/article/534453

[2]Reichert JM. Antibodies to watch in 2017[J]. MAbs，2017，9: 167–181. 

[3]趙晨曦，胡卓偉，崔冰. 單克隆抗體藥物研究進展[J]. 藥學學報，2017(06):5-15.

[4]https://www.nobelprize.org/uploads/2018/10/popular-chemistryprize2018.pdf

[5]王佳堃，孫中遠，劉建新.酵母細胞表面展示技術(shù)[J].動物營養(yǎng)學報，2011，23(11):1847-1853.

[6]Methods Mol Biol. 2015; 1319: 155–175.

[7]https://wenku.baidu.com/view/8076684aa8956bec0975e39d.htmlrec_flag=default&sxts=1568164978537

[8]https://wenku.baidu.com/view/ff8ac80ea6c30c2259019ea0.html

[9]郭園. 核糖體展示研究進展[J]. 生物技術(shù)通報，2016，32(8): 22-27

[10]https://www.docin.com/p-1515704780.html

[11]http://www.doc88.com/p-9743589141678.html
 

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