出入境口岸軍團(tuán)菌檢驗(yàn)規(guī)程
瀏覽次數(shù):124 發(fā)布日期:2019-8-16
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一、范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了出入境口岸軍團(tuán)菌檢驗(yàn)對(duì)象、方法、結(jié)果報(bào)告、生物安全要求及陽(yáng)性結(jié)果判定、處置。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于出入境口岸軍團(tuán)菌的檢驗(yàn)。
二、規(guī)范性引用文件
下列文件中的條款通過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件,其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內(nèi)容)或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn),然而,鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是未注日期的引用文件,其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。
GB19489 實(shí)驗(yàn)室 生物安全通用要求
WS195 軍團(tuán)病診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則
三、術(shù)語(yǔ)和定義
下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。
⒈軍團(tuán)病
軍團(tuán)菌屬(主要是軍團(tuán)菌)引起的細(xì)菌性呼吸道傳染病,臨床表現(xiàn)有兩種類(lèi)型,非肺炎型和肺炎型。
⒉軍團(tuán)菌
引起軍團(tuán)病的病原菌,系兼性細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性桿菌,軍團(tuán)菌是人軍團(tuán)菌是人軍團(tuán)病的主要致病菌。
四、實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù)
實(shí)驗(yàn)室結(jié)構(gòu)和設(shè)施、安全操作規(guī)程、安全設(shè)備及個(gè)體防護(hù)應(yīng)符合GB19489中二級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室的要求。
五、對(duì)象
⒈疑似感染軍團(tuán)菌的出入境人員。
⒉環(huán)境污染標(biāo)本。
六、準(zhǔn)備
⒈檢驗(yàn)試劑
⑴細(xì)菌培養(yǎng)鑒定及聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑的制備參見(jiàn)附錄A,或購(gòu)買(mǎi)符合要求的商品化檢測(cè)試劑盒。
⑵直接熒光抗體染色(DFA)、血清學(xué)檢驗(yàn)及尿抗原檢測(cè)見(jiàn)WS195或購(gòu)買(mǎi)符合要求的商品化試劑。
⒉儀器設(shè)備
儀器設(shè)備參見(jiàn)附錄A。
七、標(biāo)本的采集和處理
⒈疑似感染者標(biāo)本的采集
⑴發(fā)病期患者的痰液、纖支鏡毛刷標(biāo)本、支氣管灌洗液和肺組織可進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè),常規(guī)采樣后立即送檢,采樣過(guò)程中應(yīng)使用無(wú)菌蒸餾水。
⑵無(wú)菌方法采集發(fā)病期患者胸水,用有蓋無(wú)菌試管保存,立即送檢。
⑶用于培養(yǎng)的尿液標(biāo)本采樣前應(yīng)清洗并消毒患者尿道口,留取中段尿10ml~20ml,于無(wú)菌容器中,立即送檢。用于尿抗原檢測(cè)的標(biāo)本可常規(guī)留取中段尿。
⑷用不抗凝的真空管采集并保存患者急性期(發(fā)病3d內(nèi))、第3周、第6周血清用于血清學(xué)檢測(cè)。
⒉疑似感染者標(biāo)本的處理
⑴肺組織用蒸餾水在無(wú)菌條件下制成懸液,痰液、纖支鏡毛刷標(biāo)本、支氣管灌洗液、肺組織懸液經(jīng)酸處理或熱處理后進(jìn)行培養(yǎng)(見(jiàn)7.5)。
⑵無(wú)菌方法采集的胸水、消毒尿道口留取的中段尿,血液等正常情況下無(wú)菌的標(biāo)本無(wú)需處理直接用于培養(yǎng)。
⑶血清學(xué)試驗(yàn)的血液采集后室溫放置1h后,3000r/min離心5min,,分離出血清。
⒊環(huán)境污染標(biāo)本采集
水樣用于無(wú)菌容器采集200ml~500ml,塵土和泥土用于無(wú)菌蒸餾水制成懸液。水樣中如果含有含氯或其他氧氣指示劑,應(yīng)在取樣時(shí)或取樣前加入硫代硫酸鉀或相應(yīng)的活性試劑中和。從樣品采集,濃縮到送檢間隔不超過(guò)2d,實(shí)驗(yàn)室接到水樣后應(yīng)盡快進(jìn)行微生物學(xué)分析。
⒋環(huán)境污染標(biāo)本處理
⑴膜過(guò)濾法
采用膜過(guò)濾裝置進(jìn)行膜過(guò)濾,采用直徑47mm~147mm,孔徑0.22μm的膜。過(guò)濾后的膜應(yīng)放置在帶蓋的無(wú)菌容器中,可用無(wú)菌剪刀剪碎,加15ml的無(wú)菌稀釋液或無(wú)菌蒸餾水,不斷搖動(dòng)至少2min。也可將容器放入超聲波中10,min。
⑵離心法
取200ml樣品于300nl~500ml容器的離心瓶中,6000r/min離心10min或3000r/min離心30min,保持溫度在15℃~25℃,棄去上清液,將沉淀物懸浮在15ml無(wú)菌蒸餾水中。
⒌酸處理和熱處理
⑴處理目的
為減少痰液、纖支鏡毛刷標(biāo)本、支氣管灌洗液和肺組織懸液等正常情況有菌的標(biāo)本和環(huán)境污染的標(biāo)本中的雜菌生長(zhǎng),標(biāo)本需進(jìn)行酸處理或熱處理。同一容器內(nèi)的標(biāo)本只能選擇酸處理或熱處理中的一項(xiàng),兩種處理方法不能重復(fù)。
⑵酸處理
取患者痰液、纖支鏡毛刷標(biāo)本、支氣管灌洗液和肺組織懸液等標(biāo)本2ml,轉(zhuǎn)移至有蓋無(wú)菌試管中。取經(jīng)7.4處理過(guò)的環(huán)境污染標(biāo)本10ml,轉(zhuǎn)移至有蓋無(wú)菌試管中,3000r/min離心30min,用無(wú)菌槍頭吸去8ml體積的上清液,通過(guò)渦旋重新懸浮剩余物。每個(gè)裝有2ml標(biāo)本的有蓋無(wú)菌試管中加入8mlpH2.0酸性緩沖液,混勻,室溫靜置10min。加入堿中和試劑,調(diào)至未加酸性緩沖液時(shí)的pH值,靜置10min,待查。
⑶熱處理
取患者痰液、纖支鏡毛刷標(biāo)本、支氣管灌洗液和肺組織懸液等臨床標(biāo)本或環(huán)境污染標(biāo)本2ml,轉(zhuǎn)移至有蓋無(wú)菌容器中,50℃±1℃水浴處理30min±2min。
八、實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)方法
⒈細(xì)菌培養(yǎng)鑒定,見(jiàn)附錄B。
⒉尿液中抗原的檢測(cè),采用免疫層析法,按照相應(yīng)商品化試劑說(shuō)明書(shū)。
⒊聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè),參見(jiàn)附錄D。
⒋直接熒光抗體染色按照WS195.
⒌血清學(xué)檢測(cè)按照WS195或按照商品化試劑說(shuō)明書(shū)。
注:其他符合檢測(cè)要求的商品化試劑盒,在驗(yàn)證合格后均可參照使用,本標(biāo)準(zhǔn)不做推薦。
九、結(jié)果判定與報(bào)告
⒈細(xì)菌培養(yǎng)鑒定報(bào)告
⑴標(biāo)本中培養(yǎng)出軍團(tuán)菌,報(bào)告“細(xì)菌培養(yǎng)檢出軍團(tuán)菌”。
⑵BCYEα培養(yǎng)基或GVPC培養(yǎng)基14d內(nèi)未見(jiàn)可疑菌落,報(bào)告“細(xì)菌培養(yǎng)14d,位檢出軍團(tuán)菌”。
⒉尿抗原檢測(cè)報(bào)告
⑴尿抗原檢測(cè)陽(yáng)性,報(bào)告“尿軍團(tuán)菌抗原陽(yáng)性”。
⑵尿抗原檢測(cè)陰性,報(bào)告“尿軍團(tuán)菌抗原陰性”。
⒊PCR檢驗(yàn)報(bào)告
⑴PCR檢測(cè)陽(yáng)性,報(bào)告“軍團(tuán)菌PCR檢測(cè)陽(yáng)性”。
⑵PCR檢測(cè)陰性,報(bào)告“軍團(tuán)菌PCR檢測(cè)陰性”。
⒋血清學(xué)試驗(yàn)報(bào)告
⑴血清學(xué)試驗(yàn)陽(yáng)性,報(bào)告“軍團(tuán)菌抗體陽(yáng)性”。
⑵血清學(xué)試驗(yàn)陰性,報(bào)告“軍團(tuán)菌抗體陰性”。
十、陽(yáng)性結(jié)果的處置
⒈細(xì)菌分離培養(yǎng)陽(yáng)性的菌株應(yīng)傳代保存,疫情報(bào)告上級(jí)主管部門(mén),同時(shí)向當(dāng)?shù)匦l(wèi)生行政主管部門(mén)疾病預(yù)防控制中心通報(bào)。
⒉血清學(xué)檢測(cè)、尿抗原檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性或可疑陽(yáng)性的標(biāo)本,宜選擇直接免疫熒光抗體染色及細(xì)菌分離培養(yǎng)和PCR方法進(jìn)行復(fù)檢驗(yàn)證。
附錄A略。
附錄B
細(xì)菌培養(yǎng)鑒定
B.1初培養(yǎng)
將酸處理或熱處理的標(biāo)本3000r/min離心10min,用無(wú)菌吸管吸棄上清液,保留1ml重新懸浮沉淀物,正常情況無(wú)菌的標(biāo)本直接用于培養(yǎng),用無(wú)菌吸管吸取沉淀物懸液或正常的標(biāo)本,分別滴加1滴~2滴在BCYEα軍團(tuán)菌專(zhuān)用培養(yǎng)基和GVPC選擇性培養(yǎng)基上,劃線接種或涂布接種。35℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),連續(xù)觀察3d~7d,軍團(tuán)菌在BCYEα培養(yǎng)基上菌落通常呈現(xiàn)白色、灰色、藍(lán)色、紫色,但也可能出現(xiàn)棕色粉色灰綠色或深紅色。軍團(tuán)菌表面光滑,邊緣整齊,出現(xiàn)典型的毛玻璃現(xiàn)象。發(fā)現(xiàn)上述菌落即為軍團(tuán)菌可疑菌落,進(jìn)行下一步分離培養(yǎng)鑒定。無(wú)可疑菌落,培養(yǎng)順延至14d,報(bào)告“細(xì)菌培養(yǎng)14天,未檢出軍團(tuán)菌”。
B.2 分離培養(yǎng)
挑取初培養(yǎng)可疑菌落分別在BCYEα培養(yǎng)基和BCYE-Cys培養(yǎng)基或血平板上劃線接種。35℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),觀察2d~4d,在BCYEα培養(yǎng)基上見(jiàn)到菌落形成而B(niǎo)CYE-Cys培養(yǎng)基或血平板上未見(jiàn)生長(zhǎng),即初步判定為軍團(tuán)菌,用軍團(tuán)菌診斷血清做分型試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。聚合酶鏈反應(yīng)可輔助用于軍團(tuán)菌到鑒定,作為參考。