近年來，抗體藥物的接連上市和重磅銷售引發(fā)國內(nèi)外抗體類生物治療藥物的研發(fā)熱潮。活性測定是對藥物的有效成分和含量以及藥物效價的測定，是確�？贵w類藥物有效性的重要質(zhì)控指標。現(xiàn)階段抗體藥物的活性分析方法主要是體外( in vitro) 檢測，主要有基于細胞、轉(zhuǎn)基因細胞以及新技術(shù)應(yīng)用三方面對抗體藥物活性測定的方法，為抗體藥物的研發(fā)和質(zhì)量控制提供新思路^[1]。

小編今天主要分享基于新技術(shù)的生物學(xué)活性測定方法，此方法可應(yīng)用于抗體類藥物的活性評價，包括表面等離子共振效價測定法、均相時間分辨熒光、 Alpha技術(shù)、熒光染料標記法等。
 

表面等離子共振效價測定法

 

表面等離子共振技術(shù)（SurfacePlasmonResonance，SPR）是一種用于生物分子間相互作用分析的新技術(shù)，在抗體藥物的研發(fā)、生產(chǎn)以及質(zhì)量控制方面取得了良好的應(yīng)用。近年來該技術(shù)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域比較新穎，在技術(shù)方面不斷更新，在靈敏度、特異性以及實用性取得了較大的進步。此外在抗體制藥行業(yè)中占據(jù)著巨大的優(yōu)勢。 

表面等離子共振現(xiàn)象是發(fā)生在兩種折射率不同的介質(zhì)界面上的一種光學(xué)現(xiàn)象。當光源的一束入射光從高折射率介質(zhì)(如玻璃)射向低折射率介質(zhì)(如溶液)的界面時，如果入射角大于一定的臨界角，入射光將會被100%地反射至光源的同一側(cè)，這叫做全反射現(xiàn)象。當兩種介質(zhì)之間有一層極薄的金屬膜(最為常見的50nm金膜)，這時入射光的能量將會引起金膜中等離子體的共振并以一種電磁場(稱作消逝波)的方式彌散至低折射率介質(zhì)一側(cè)(如溶液)，從而導(dǎo)致反射光的能量在某個特定的角度降至最低，這一角度被稱作SPR角^[1]，因此可以通過對生物反應(yīng)過程中SPR角的動態(tài)變化獲取生物分子之間相互作用的特異信號。該技術(shù)的樣品消耗量較低，一般僅有微克級；也無需預(yù)先標記熒光、二抗的分子；同時使用親和力信息及動力學(xué)信息來闡述分子間結(jié)合機理。

圖1 SPR技術(shù)作用原理^[2]

 

均相時間分辨熒光

 

均相時間分辨熒光（homogeneous time-resolved fluorescence，HTRF）是用來檢測純液相體系中待測物的一種常用方法，也是用來研究藥物靶標的理想平臺。該技術(shù)結(jié)合了熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET，F(xiàn)luorescence Resonance Energy Transfer）和時間分辨熒光（TRF，Time Resolved Fluorescence)）兩種技術(shù)。HTRF技術(shù)是利用了供體（如Eu穴狀化合物，長壽命熒光）和受體（如XL665，短壽命熒光）之間接近時產(chǎn)生的熒光共振能量轉(zhuǎn)移。因為Eu的熒光衰減周期較長，所以含Eu的供體會誘導(dǎo)XL665受體長時間地發(fā)射熒光，受體激發(fā)后產(chǎn)生的熒光便能持續(xù)較長時間，通過時間分辨就可以區(qū)分那些短壽命的自身散射的熒光，這樣從短壽命熒光背景中就很容易區(qū)分出FRET信號^[3]，此信號與結(jié)合產(chǎn)物形成成正比，采用雙波長激發(fā)光可以檢測生物分子相互作用下的熒光信號變化，減少緩沖液和介質(zhì)的干擾。 

HTRF技術(shù)進入藥物研發(fā)領(lǐng)域以來，加快了很多基于抗體的研究，因為HTRF具有同等的檢測范圍和檢測極限，不需要洗滌步驟，實驗方式操作簡單，而且減少了實驗時間和花費。所以該技術(shù)近年來已被應(yīng)用于抗體的活性檢測。
 

圖2 HTRF技術(shù)原理^[4]

 

Alpha技術(shù)

 

近年來，Alpha技術(shù)（Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay）也應(yīng)用于抗體的活性檢測，該技術(shù)需要兩個由不同的化學(xué)混合物組成的微珠，分別為供體微珠(Donorbeads)和受體微珠(Acceptorbeads)。兩種微珠分別行使不同的功能，其中供體微珠包含了光敏劑苯二甲藍(Phthalocyanine)，在680nm激光的照射下，它周圍環(huán)境中的氧分子轉(zhuǎn)化成一種高能活躍的氧狀態(tài)-單體氧(Singlet Oxygen)。供體微珠能夠產(chǎn)生大約60,000個左右的單體氧小分子，10在4μs的半衰期內(nèi)，單體氧可以在溶液中擴散高達200nm的距離。如果在該范圍內(nèi)存在受體微珠，單體氧就會觸發(fā)受體微珠的二甲基噻吩衍生物，繼而通過激發(fā)一系列的化學(xué)反應(yīng)，最終在520-620nm產(chǎn)生光信號，從而達到檢測目的^[5]。 

 

圖3 Alpha技術(shù)作用原理^[6]

 

隨著各類新型生物標志物以及藥物靶點的發(fā)現(xiàn)，尤其是近年來抗體等生物大分子的迅猛發(fā)展，Alpha技術(shù)依靠其自身的優(yōu)勢和特點，能夠應(yīng)用到各個研究領(lǐng)域，包括血管生成、癌癥、心血管、炎癥、等多種疾病領(lǐng)域。特別是在藥物研發(fā)領(lǐng)域，由于其供穩(wěn)定的、高靈敏的、可自動化的、可重復(fù)且低成本的特點，它將會受到越來越多的科研工作者的青睞。

 

熒光染料標記法

 

在近幾年飛速發(fā)展的研究進展中，熒光染料標記法已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)標記、DNA檢測、醫(yī)藥衛(wèi)生和環(huán)境檢測等領(lǐng)域。近年來BODIPY(氟化硼二吡咯)類熒光染料作為一類新型的熒光染料，由于其優(yōu)良的性質(zhì)和廣闊的應(yīng)用前景在過去的二十年內(nèi)得到廣泛的研究。與其它的熒光染料相比，BODIPY類熒光染料的光譜峰寬比較窄、檢測靈敏度較高、較高的摩爾吸光系數(shù)、光穩(wěn)定性能非常優(yōu)越以及較高的熒光量子產(chǎn)率等。

例如，抗PCSK9單抗的的生物活性測定即是用BODIPY標記的低密度脂蛋白(LDL)通過HepG2細胞來測定其生物活性。Evolocumab是一款靶向PCSK9的單克隆抗體。當它與PCSK9結(jié)合后，能抑制PCSK9結(jié)合低密度脂蛋白受體（LDL-R）。在沒有藥物存在的情況下，這些LDL-R通過與PCSK9的結(jié)合，會被降解。而在evolocumab的作用下，LDL-R能逃脫被降解的厄運，回到肝細胞表面，清除血液里的低密度脂蛋白，從而降低血液中的低密度脂蛋白膽固醇水平^[7]�？筆CSK9抗體能夠與PCSK9結(jié)合，阻滯PCSK9與LDLR結(jié)合，增加LDLR數(shù)目，從而增加HepG2細胞中BODIPY標記的LDL熒光量。

 

 

圖4 PCSK9抑制劑的作用機制^[8]

 

參考資料

 

[1] 王蘭，徐岡，等. 抗體類生物治療藥物活性測定方法. 中國生物工程雜志，2015，35（6）：101—108

[2] 朱磊，高凱，等．單克隆抗體生物治療藥物研究進展．中國藥學(xué)雜志，2014，49（23）：2058-2064．

[3] http://meeting.dxy.cn/Cisbio2011/article/i15729.html

[4] François Degorce, Amy Card, et al. HTRF: A Technology Tailored for Drug Discovery–A Review of Theoretical Aspects and Recent Applications. Current Chemical Genomics, 2009, 3, 22-32

[5] https://med.sina.com/article_detail_103_2_11911.html

[6] https://data.pharmacodia.com

[7] http://m.sohu.com/a/160671003_282570?_f=m-article_24_feeds_3

[8] PharmDr.Anna Oleárová, PhD., MPH,et al. Novel targeted therapeutics in dyslipoproteinemia, Prakt. lekarn., 2015; 5(3-4): 92–96

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