結核分枝桿菌的研究歷史及生物學性狀
一、結核分枝桿菌的研究歷史
結核分枝桿菌（M. tuberculosis）簡稱為結核桿菌（tubercle bacilli）。早在1882年，德國細菌學家柯赫（Robert Koch，1843-1910）就已證明結核分枝桿菌是結核病的病原菌。本菌可侵犯全身各組織器官，但以肺部感染最多見。隨著抗結核藥物的不斷發(fā)展和衛(wèi)生生活狀況的改善，結核的發(fā)病率和死亡率曾一度大幅下降。20世紀80年代后，由于艾滋病和結核分枝桿菌耐藥菌株的出現、免疫抑制劑的應用、吸毒、貧困及人口流動等因素，全球范圍內結核病的疫情驟然惡化。據WHO統(tǒng)計，全世界約每3個人中就有1個人感染了結核分枝桿菌，在某些發(fā)展中國家成人中結核分枝桿菌攜帶率高達80%，其中約5%～10%攜帶者可發(fā)展為活動性結核病。近二十年由于艾滋病的流行，感染了HIV的結核分枝桿菌攜帶者，由于病毒破壞了機體的免疫功能，發(fā)展為活動性結核病的可能性比未感染HIV者高30～50倍，且結核的病程發(fā)展更快。
此外，在HIV感染的發(fā)展進程中，結核是最早發(fā)生的一種機會性感染，結核病加重了HIV感染者或艾滋病人的疾病負擔，使其更易死亡。21世紀以來全球每年約出現8百萬結核新病例，并導致約3百萬人死亡。中國每年死于結核病的人約25萬之多，是各類傳染病死亡人數總和的兩倍多。因此，結核病又成為了威脅人類健康的全球性衛(wèi)生問題，并成為某些發(fā)展中國家和地區(qū)，特別是艾滋病高發(fā)區(qū)人群的首要死因。
二、結核分枝桿菌生物學性狀
⒈形態(tài)與染色
結核分枝桿菌為細長略帶彎曲的桿菌，大小1～4X0.4μm。牛分枝桿菌則比較粗短。分枝桿菌屬的細菌細胞壁脂質含量較高，約占干重的60%，特別是有大量分枝菌酸（mycolic acid）包圍在肽聚糖層的外面，可影響染料的穿入。分枝桿菌一般用齊尼（Ziehl- Neelsen）抗酸染色法，以5% 石炭酸復紅加溫染色后可以染上，但用3%鹽酸乙醇不易脫色。若再加用美藍復染，則分枝桿菌呈紅色，而其他細菌和背景中的物質為藍色。本菌無芽孢、無鞭毛。
近年發(fā)現結核分枝桿菌在細胞壁外尚有一層莢膜。一般因制片時遭受破壞而不易看到。若在制備電鏡標本固定前用明膠處理，可防止莢膜脫水收縮。在電鏡下可看到菌體外有一層較厚的透明區(qū)，即莢膜，莢膜對結核分枝桿菌有一定的保護作用。
結核分枝桿菌在體內外經青霉素、環(huán)絲氨酸或溶菌酶誘導可影響細胞壁中肽聚糖的合成，異煙肼影響分枝菌酸的合成，巨噬細胞吞噬結核分枝桿菌后溶菌酶的作用可破壞肽聚糖，均可導致其變?yōu)長型，呈顆粒狀或絲狀。異煙肼影響分枝菌酸的合成，可變?yōu)榭顾崛旧幮�。這種形態(tài)多形染色多變在肺內外結核感染標本中常能見到。臨床結核性冷膿瘍和痰標本中甚至還可見有非抗酸性革蘭陽性顆粒，過去稱為Much顆粒。該顆粒在體內或細胞培養(yǎng)中能返回為抗酸性桿菌，故亦為L型。
⒉培養(yǎng)特性
專性需氧。最適溫度為37℃，低于30℃不生長。結核分枝桿菌細胞壁的脂質含量較高，影響營養(yǎng)物質的吸收，故生長緩慢。在一般培養(yǎng)基中每分裂1代需時18～24小時，營養(yǎng)豐富時只需5小時。
初次分離需要營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基。常用的有羅氏（Lowenstein-Jensen）固體培養(yǎng)基，內含蛋黃、甘油、馬鈴薯、無機鹽和孔雀綠等�？兹妇G可抑制雜菌生長，便于分離和長期培養(yǎng)。蛋黃含脂質生長因子，能刺激生長。根據接種菌多少，一般2～4周可見菌落生長。菌落呈顆粒、結節(jié)或花菜狀，乳白色或米黃色，不透明。在液體培養(yǎng)基中可能由于接觸營養(yǎng)面大，細菌生長較為迅速。一般1～2周即可生長。臨床標本檢查液體培養(yǎng)比固體培養(yǎng)的陽性率高數倍。
⒊生化反應
結核分枝桿菌不發(fā)酵糖類。與牛分枝桿菌的區(qū)別在于結核分枝桿菌可合成煙酸和還原硝酸鹽，而牛分枝桿菌不能。熱觸酶試驗對區(qū)別結核分枝桿菌與非結核分枝桿菌有重要意義。結核分枝桿菌大多數觸酶試驗陽性，而熱觸酶試驗陰性； 非結核分枝桿菌則大多數兩種試驗均陽性。熱觸酶試驗檢查方法是將濃的細菌懸液置68℃水浴加溫20分鐘，然后再加H2O2。觀察是否產生氣泡，有氣泡者為陽性。
⒋抵抗力
結核分枝桿菌細胞壁中含有脂質，故對乙醇敏感，在70%乙醇中2min死亡。此外，脂質可防止菌體水分丟失，故對干燥的抵抗力特別強。粘附在塵埃上保持傳染性8～10d，在干燥痰內可存活6～8個月。結核分枝桿菌對濕熱敏感，在液體中加熱62～63℃ 15分鐘或煮沸即被殺死。結核分枝桿菌對紫外線敏感。直接日光照射數小時可被殺死，可用于結核患者衣服、書籍等的消毒。
結核分枝桿菌的抵抗力與環(huán)境中有機物的存在有密切關系，如痰液可增強結核分枝桿菌的抵抗力。因大多數消毒劑可使痰中的蛋白質凝固，包在細菌周圍，使細菌不易被殺死。5%石炭酸在無痰時30min可殺死結核分枝桿菌，有痰時需要24h；5% 來蘇兒無痰時5min殺死結核分枝桿菌，有痰時需要1～2h。
結核分枝桿菌對酸（3% HCl或6% H2SO4）或堿（4% NaOH）有抵抗力，15分鐘不受影響。可在分離培養(yǎng)時用于處理有雜菌污染的標本和消化標本中的粘稠物質。結核分枝桿菌對1：13 000孔雀綠有抵抗力，加在培養(yǎng)基中可抑制雜菌生長。結核分枝桿菌對鏈霉素、異煙肼、利福平、環(huán)絲氨酸、乙胺丁醇、卡那霉素、對氨基水楊酸等敏感，但長期用藥容易出現耐藥性，而吡嗪酰胺的耐藥性<5%。
⒌變異性
結核分枝桿菌可發(fā)生形態(tài)、菌落、毒力、免疫原性和耐藥性等變異�？ń槊纾˙CG）就是Calmette和Guerin （1908）將牛結核分枝桿菌在含甘油、膽汁、馬鈴薯的培養(yǎng)基中經13年230次傳代而獲得的減毒活疫苗株，現廣泛用于預防接種。
⒍強韌性
因結核桿菌體內含有大量類脂質，占結核菌干重的40%，細胞壁內含量最多，因其富脂外壁的疏水性之故，一般的消毒劑難以滲入，對外界條件有異常大的抵抗力，使通常的滅菌方法易失敗，15%硫酸或15%氫氧化鈉溶液處理30分鐘，可殺死一般的病原菌，但不能殺死結核桿菌。在陰暗潮濕的地方可生存數月，在陽光暴曬下能生存數小時，在-7℃以下可生存4~5年。但在沸水中（100℃）數分鐘可死亡，因此，煮沸消毒是最有效最經濟的方法。醇脂性溶劑———酒精能滲入其酯層而發(fā)揮奇效，用75%酒精2分鐘便可將它殺死。
⒎條件性
結核菌在含氧40%~50%并有5%~10%CO2和溫度為36℃±5℃，合適PH值為6.8~7.2的條件下生長旺盛，并且在一般的培養(yǎng)基上結核桿菌是不生長的，它必須在含有血清、卵黃、馬鈴薯、甘油以及某些無機鹽類的特殊培養(yǎng)基上才能生長。所以結核菌最易侵犯氧氣充足、血流、營養(yǎng)豐富的肺臟以及骨骼的兩端。結核桿菌無論在什么環(huán)境中的存在，都已顯示出，它是細菌家族中最優(yōu)秀的菌種之一。
⒏懶惰性
結核桿菌生長緩慢，無運動能力，性情懶惰，其最快分裂增殖速度為18小時一代，而大多數細菌都是幾分鐘或幾十分鐘便繁殖一代，如大腸桿菌約需20分鐘便可繁殖一代，10小時后，一個大腸桿菌繁殖10億個以上，可是一個結核桿菌18個小時才繁殖2個�？蓜e小看或輕視結核桿菌帶有這種欺騙性形似疲憊的懶惰行為，大量科學家在實驗室或醫(yī)務人員在臨床與它進行長期斗爭的實踐一再證明，我們與它斗爭的手段還沒有提高到一個高水平上來。
⒐易發(fā)生耐藥性
在固體培養(yǎng)基中對常用的含異煙肼1mg、鏈霉素10mg、利福平50mg能生長的結核分枝桿菌為耐藥菌。耐藥菌株毒力有所減弱。異煙肼可影響細胞壁中分枝菌酸的合成，誘導結核分枝桿菌成為L型，此可能是耐異煙肼的一種原因。藥物敏感試驗表明對異煙肼耐藥，而對利福平和鏈霉素大多仍敏感。故目前治療多主張異煙肼和利福平或吡嗪酰胺聯(lián)合用藥，以減少耐藥性的產生，增強療效。臨床上耐異煙肼菌株致病性也有所減弱。實驗證明豚鼠感染結核分枝桿菌常于6周內死亡，且肝內見有粟粒性病灶； 而感染L型后往往要百余天才死亡，病灶缺乏典型結核結節(jié)病變。但L型有回復的特性，未經徹底治療可導致復發(fā)。
近年來世界各地結核分枝桿菌的多耐菌株逐漸增多，甚至引起暴發(fā)流行。結核分枝桿菌的耐藥可由自發(fā)突變產生（原發(fā)性耐藥）或由用藥不當經突變選擇產生（繼發(fā)性耐藥）。但多耐的產生主要可能由于后者。耐藥基因在染色體上，對不同藥物的耐藥基因不相連接，所以聯(lián)合用藥治療有效。對異煙肼耐藥與katG基因丟失有關。易感株有該基因，耐藥株無。利福平主要作用于RNA多聚酶。編碼該酶的基因（rpoB）突變則引起對利福平耐藥。1999年國內報道7株耐利福平株全部rpoB基因發(fā)生突變。敏感株則否。
結核分枝桿菌（M. tuberculosis）簡稱為結核桿菌（tubercle bacilli）。早在1882年，德國細菌學家柯赫（Robert Koch，1843-1910）就已證明結核分枝桿菌是結核病的病原菌。本菌可侵犯全身各組織器官，但以肺部感染最多見。隨著抗結核藥物的不斷發(fā)展和衛(wèi)生生活狀況的改善，結核的發(fā)病率和死亡率曾一度大幅下降。20世紀80年代后，由于艾滋病和結核分枝桿菌耐藥菌株的出現、免疫抑制劑的應用、吸毒、貧困及人口流動等因素，全球范圍內結核病的疫情驟然惡化。據WHO統(tǒng)計，全世界約每3個人中就有1個人感染了結核分枝桿菌，在某些發(fā)展中國家成人中結核分枝桿菌攜帶率高達80%，其中約5%～10%攜帶者可發(fā)展為活動性結核病。近二十年由于艾滋病的流行，感染了HIV的結核分枝桿菌攜帶者，由于病毒破壞了機體的免疫功能，發(fā)展為活動性結核病的可能性比未感染HIV者高30～50倍，且結核的病程發(fā)展更快。
此外，在HIV感染的發(fā)展進程中，結核是最早發(fā)生的一種機會性感染，結核病加重了HIV感染者或艾滋病人的疾病負擔，使其更易死亡。21世紀以來全球每年約出現8百萬結核新病例，并導致約3百萬人死亡。中國每年死于結核病的人約25萬之多，是各類傳染病死亡人數總和的兩倍多。因此，結核病又成為了威脅人類健康的全球性衛(wèi)生問題，并成為某些發(fā)展中國家和地區(qū)，特別是艾滋病高發(fā)區(qū)人群的首要死因。
二、結核分枝桿菌生物學性狀
⒈形態(tài)與染色
結核分枝桿菌為細長略帶彎曲的桿菌，大小1～4X0.4μm。牛分枝桿菌則比較粗短。分枝桿菌屬的細菌細胞壁脂質含量較高，約占干重的60%，特別是有大量分枝菌酸（mycolic acid）包圍在肽聚糖層的外面，可影響染料的穿入。分枝桿菌一般用齊尼（Ziehl- Neelsen）抗酸染色法，以5% 石炭酸復紅加溫染色后可以染上，但用3%鹽酸乙醇不易脫色。若再加用美藍復染，則分枝桿菌呈紅色，而其他細菌和背景中的物質為藍色。本菌無芽孢、無鞭毛。
近年發(fā)現結核分枝桿菌在細胞壁外尚有一層莢膜。一般因制片時遭受破壞而不易看到。若在制備電鏡標本固定前用明膠處理，可防止莢膜脫水收縮。在電鏡下可看到菌體外有一層較厚的透明區(qū)，即莢膜，莢膜對結核分枝桿菌有一定的保護作用。
結核分枝桿菌在體內外經青霉素、環(huán)絲氨酸或溶菌酶誘導可影響細胞壁中肽聚糖的合成，異煙肼影響分枝菌酸的合成，巨噬細胞吞噬結核分枝桿菌后溶菌酶的作用可破壞肽聚糖，均可導致其變?yōu)長型，呈顆粒狀或絲狀。異煙肼影響分枝菌酸的合成，可變?yōu)榭顾崛旧幮�。這種形態(tài)多形染色多變在肺內外結核感染標本中常能見到。臨床結核性冷膿瘍和痰標本中甚至還可見有非抗酸性革蘭陽性顆粒，過去稱為Much顆粒。該顆粒在體內或細胞培養(yǎng)中能返回為抗酸性桿菌，故亦為L型。
⒉培養(yǎng)特性
專性需氧。最適溫度為37℃，低于30℃不生長。結核分枝桿菌細胞壁的脂質含量較高，影響營養(yǎng)物質的吸收，故生長緩慢。在一般培養(yǎng)基中每分裂1代需時18～24小時，營養(yǎng)豐富時只需5小時。
初次分離需要營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基。常用的有羅氏（Lowenstein-Jensen）固體培養(yǎng)基，內含蛋黃、甘油、馬鈴薯、無機鹽和孔雀綠等�？兹妇G可抑制雜菌生長，便于分離和長期培養(yǎng)。蛋黃含脂質生長因子，能刺激生長。根據接種菌多少，一般2～4周可見菌落生長。菌落呈顆粒、結節(jié)或花菜狀，乳白色或米黃色，不透明。在液體培養(yǎng)基中可能由于接觸營養(yǎng)面大，細菌生長較為迅速。一般1～2周即可生長。臨床標本檢查液體培養(yǎng)比固體培養(yǎng)的陽性率高數倍。
⒊生化反應
結核分枝桿菌不發(fā)酵糖類。與牛分枝桿菌的區(qū)別在于結核分枝桿菌可合成煙酸和還原硝酸鹽，而牛分枝桿菌不能。熱觸酶試驗對區(qū)別結核分枝桿菌與非結核分枝桿菌有重要意義。結核分枝桿菌大多數觸酶試驗陽性，而熱觸酶試驗陰性； 非結核分枝桿菌則大多數兩種試驗均陽性。熱觸酶試驗檢查方法是將濃的細菌懸液置68℃水浴加溫20分鐘，然后再加H2O2。觀察是否產生氣泡，有氣泡者為陽性。
⒋抵抗力
結核分枝桿菌細胞壁中含有脂質，故對乙醇敏感，在70%乙醇中2min死亡。此外，脂質可防止菌體水分丟失，故對干燥的抵抗力特別強。粘附在塵埃上保持傳染性8～10d，在干燥痰內可存活6～8個月。結核分枝桿菌對濕熱敏感，在液體中加熱62～63℃ 15分鐘或煮沸即被殺死。結核分枝桿菌對紫外線敏感。直接日光照射數小時可被殺死，可用于結核患者衣服、書籍等的消毒。
結核分枝桿菌的抵抗力與環(huán)境中有機物的存在有密切關系，如痰液可增強結核分枝桿菌的抵抗力。因大多數消毒劑可使痰中的蛋白質凝固，包在細菌周圍，使細菌不易被殺死。5%石炭酸在無痰時30min可殺死結核分枝桿菌，有痰時需要24h；5% 來蘇兒無痰時5min殺死結核分枝桿菌，有痰時需要1～2h。
結核分枝桿菌對酸（3% HCl或6% H2SO4）或堿（4% NaOH）有抵抗力，15分鐘不受影響。可在分離培養(yǎng)時用于處理有雜菌污染的標本和消化標本中的粘稠物質。結核分枝桿菌對1：13 000孔雀綠有抵抗力，加在培養(yǎng)基中可抑制雜菌生長。結核分枝桿菌對鏈霉素、異煙肼、利福平、環(huán)絲氨酸、乙胺丁醇、卡那霉素、對氨基水楊酸等敏感，但長期用藥容易出現耐藥性，而吡嗪酰胺的耐藥性<5%。
⒌變異性
結核分枝桿菌可發(fā)生形態(tài)、菌落、毒力、免疫原性和耐藥性等變異�？ń槊纾˙CG）就是Calmette和Guerin （1908）將牛結核分枝桿菌在含甘油、膽汁、馬鈴薯的培養(yǎng)基中經13年230次傳代而獲得的減毒活疫苗株，現廣泛用于預防接種。
⒍強韌性
因結核桿菌體內含有大量類脂質，占結核菌干重的40%，細胞壁內含量最多，因其富脂外壁的疏水性之故，一般的消毒劑難以滲入，對外界條件有異常大的抵抗力，使通常的滅菌方法易失敗，15%硫酸或15%氫氧化鈉溶液處理30分鐘，可殺死一般的病原菌，但不能殺死結核桿菌。在陰暗潮濕的地方可生存數月，在陽光暴曬下能生存數小時，在-7℃以下可生存4~5年。但在沸水中（100℃）數分鐘可死亡，因此，煮沸消毒是最有效最經濟的方法。醇脂性溶劑———酒精能滲入其酯層而發(fā)揮奇效，用75%酒精2分鐘便可將它殺死。
⒎條件性
結核菌在含氧40%~50%并有5%~10%CO2和溫度為36℃±5℃，合適PH值為6.8~7.2的條件下生長旺盛，并且在一般的培養(yǎng)基上結核桿菌是不生長的，它必須在含有血清、卵黃、馬鈴薯、甘油以及某些無機鹽類的特殊培養(yǎng)基上才能生長。所以結核菌最易侵犯氧氣充足、血流、營養(yǎng)豐富的肺臟以及骨骼的兩端。結核桿菌無論在什么環(huán)境中的存在，都已顯示出，它是細菌家族中最優(yōu)秀的菌種之一。
⒏懶惰性
結核桿菌生長緩慢，無運動能力，性情懶惰，其最快分裂增殖速度為18小時一代，而大多數細菌都是幾分鐘或幾十分鐘便繁殖一代，如大腸桿菌約需20分鐘便可繁殖一代，10小時后，一個大腸桿菌繁殖10億個以上，可是一個結核桿菌18個小時才繁殖2個�？蓜e小看或輕視結核桿菌帶有這種欺騙性形似疲憊的懶惰行為，大量科學家在實驗室或醫(yī)務人員在臨床與它進行長期斗爭的實踐一再證明，我們與它斗爭的手段還沒有提高到一個高水平上來。
⒐易發(fā)生耐藥性
在固體培養(yǎng)基中對常用的含異煙肼1mg、鏈霉素10mg、利福平50mg能生長的結核分枝桿菌為耐藥菌。耐藥菌株毒力有所減弱。異煙肼可影響細胞壁中分枝菌酸的合成，誘導結核分枝桿菌成為L型，此可能是耐異煙肼的一種原因。藥物敏感試驗表明對異煙肼耐藥，而對利福平和鏈霉素大多仍敏感。故目前治療多主張異煙肼和利福平或吡嗪酰胺聯(lián)合用藥，以減少耐藥性的產生，增強療效。臨床上耐異煙肼菌株致病性也有所減弱。實驗證明豚鼠感染結核分枝桿菌常于6周內死亡，且肝內見有粟粒性病灶； 而感染L型后往往要百余天才死亡，病灶缺乏典型結核結節(jié)病變。但L型有回復的特性，未經徹底治療可導致復發(fā)。
近年來世界各地結核分枝桿菌的多耐菌株逐漸增多，甚至引起暴發(fā)流行。結核分枝桿菌的耐藥可由自發(fā)突變產生（原發(fā)性耐藥）或由用藥不當經突變選擇產生（繼發(fā)性耐藥）。但多耐的產生主要可能由于后者。耐藥基因在染色體上，對不同藥物的耐藥基因不相連接，所以聯(lián)合用藥治療有效。對異煙肼耐藥與katG基因丟失有關。易感株有該基因，耐藥株無。利福平主要作用于RNA多聚酶。編碼該酶的基因（rpoB）突變則引起對利福平耐藥。1999年國內報道7株耐利福平株全部rpoB基因發(fā)生突變。敏感株則否。
