生物藥品活性成分常用檢測方法及局限性

隨著生物藥品的迅速發(fā)展，研究人員將面臨的一項挑戰(zhàn)任務(wù)是開發(fā)一種可靠、耐用和高效的檢測方法，以在體外和體內(nèi)檢測和量化有效的生物藥品成分。

最常用的方法包括經(jīng)典配體結(jié)合測定(LBAS)、LC-MS的測定，以及新出現(xiàn)的LBA-LC-MS混合技術(shù)。LC-MS和LBA-LC-MS是一個技術(shù)先進(jìn)的方法，但是操作復(fù)雜，周期長，通量低，成本高，不適合于快速篩選和早期開發(fā)研究大樣本量的實(shí)際需求。

對于LBAS而言，ELISA是最常用的用于定量目的的方法。雖然在技術(shù)上要求較低并且成本低，但它高度特異性的抗體對，但是新的重組肽或蛋白質(zhì)通常是不容易拿到高質(zhì)量的抗體對。篩選可用的抗體對是耗時和費(fèi)力的，涉及昂貴的純化步驟，并且依賴于使用的動物。另外，抗體可能無法檢測所有重組蛋白質(zhì)構(gòu)建體變體。

另一種常見的LBA是傳統(tǒng)的Western印跡法，但是無法準(zhǔn)確定量，操作繁瑣，不穩(wěn)定，不符合生物藥品準(zhǔn)確性，耐用性和穩(wěn)定性的要求。

基于Wes建立生物藥品活性成分檢測方法

（體外穩(wěn)定性實(shí)驗和體內(nèi)藥物代謝動力學(xué)）

俄亥俄州立大學(xué)藥學(xué)院的科學(xué)家，基于ProteinSimple的Wes定量Western blot技術(shù)開發(fā)了一種新的，高效，高靈敏度的定量工具，以支持治療性重組蛋白的早期開發(fā)，避免上述限制。

An efficient and quantitative assay for epitope-tagged therapeutic protein development with a capillary western system，Bioanalysis，Published online:20 March 2019。

簡述：本研究使用的重組蛋白，分子量約為55kDa，N端6X-His-標(biāo)記，C末端DYKDDDDK(FLAG)。抗體：生物素化的抗Flag抗體，鏈霉親和素-HRP。Wes單次可以檢測25個樣品，在從樣品處理開始到數(shù)據(jù)采集的6小時內(nèi)（Wes操作及檢測時間約為3.5小時).

LLOQ為0.4nM(20ng/mL)。作者基于該平臺完成了一個方法開發(fā)快，高效的，檢測速度快的重組蛋白類藥物的體外穩(wěn)定性研究和藥代動力學(xué)（PK）研究的技術(shù)平臺，且無需產(chǎn)生特異性單克隆抗體。該方法也消除了目標(biāo)蛋白富集步驟，富集可能引入顯著的樣本間變異性。

Wes自動化的免疫測定平臺，基于毛細(xì)管電泳技術(shù)，整合了免疫學(xué)檢測方法。

在生物制藥領(lǐng)域具有一系列獨(dú)特優(yōu)勢

1. 全程自動化

2. 精密度高

3. 耐用性好

4. 靈敏度高

5. 準(zhǔn)確定量
 

部分結(jié)果

精密度

體外穩(wěn)定性實(shí)驗

體內(nèi)藥物代謝動力學(xué)（PK）實(shí)驗

作者文章總結(jié)
• Development and validation of a reliable, robust and efficient assay to detect and quantifymacromolecules in vitro and in vivo during the early stage of a biotherapeutic agent discovery remain a major challenge for researchers, especially in the academia setting where resources can be limited.
• A simple (enrichment-free), highly sensitive and efficient immunoassay using a capillary-based western system to assess the in vitro stability and pharmacokinetic properties of propitious epitope-tagged recombinant proteins in vivo in mouse to support an early stage development of a lead therapeutic recombinant protein.
• The method validation results demonstrated satisfactory characteristics in specificity, linearity, accuracy and precision.
• This protocol avoids the need of laborious and costly customized monoclonal antibody as is typically essential for an ELISA or multistep enrichment process which are often indispensable when employing a liquid chromatography–mass spectrometry-based method.
• The protocol is capable of quantifying up to 25 samples at the dynamic concentration range from 5 to 200 ng/ml with an LLOQ of the target protein at 0.4 nM (20 ng/ml).

方法學(xué)的優(yōu)化，請閱讀文章原文