類器官熒光染色實驗流程
固定
注意: 合并2-3孔的幾十個類器官最為理想，但也可只使用一個孔的類器官。
使用PFA固定和O.C.T包埋的實驗流程
使用1.5 mL的EP管收集類器官，使用4% PFA溶液室溫固定半小時。室溫下用PBS清洗3次，每次5分鐘。然后將樣本轉(zhuǎn)移至30% 蔗糖溶液4度孵育過夜。第二天，移除蔗糖溶液，在O.C.T中孵育15分鐘。將類器官轉(zhuǎn)移至組織模具中，置于-20度，繼續(xù)在O.C.T中進行包埋。可于-80度儲存或進行冷凍切片。
使用福爾馬林固定和瓊脂糖包埋的實驗流程
1. 從孔板中吸出培養(yǎng)基。加入1 mL的福爾馬林。
2. 使用1 mL的槍頭輕柔地重懸類器官和基質(zhì)膠，將混合物轉(zhuǎn)移至EP管中。將所需的所有孔的類器官加入同一EP管中。（也可以在孔板中進行固定，一起重懸）
3. 輕輕混合，放在冰上孵育至少一個小時。
4. 4度，1500 rpm，離心5分鐘。
5. 小心地吸出福爾馬林。
6. 用冰冷的PBS清洗，4度，1500 rpm，離心5分鐘，小心吸出PBS。重復(fù)至少兩次。（為了幫助去除Matrigel，也可加入Cell recovery medium，冰上孵育15-30分鐘）
7. 使用冷的福爾馬林重懸將類器官，4度孵育過夜。
注意：染色方面，類器官切片的處理方式與其他組織切片一樣，使用一般脫蠟，補液，抗原修復(fù)等的常規(guī)步驟。
hPSC-Derived Intestinal Organoid, EPCAM (Green), KRT20 (Red), Desmin (White), DAPI (Blue)
8. 準備模具：準備1條8-strip PCR管，分成單個管，切掉管的下半部分，得到一個圓環(huán)作為模具。將模具放到培養(yǎng)皿中，使其與底部平齊，然后放在冰上。
9. 使用福爾馬林輕柔的混合類器官，4度，1500 rpm離心5分鐘。輕輕吸出福爾馬林，不要接觸到沉淀的類器官。如果觀測到成塊的基質(zhì)膠，可使用BD cell recovery medium冰上孵育30分鐘。再次離心，盡量吸出所有的液體。
10. 使用無菌的PBS配制3% 低融點的瓊脂糖。使用微波爐加熱至完全融化。
11. 趁瓊脂糖溶液還保持溫熱的液體狀態(tài)時，使用75 µL的瓊脂糖液體輕柔地重懸類器官。如果使用 200 µL或更小的槍頭，剪掉槍頭尾部，防止損傷類器官。
12. 立即將重懸后的類器官和瓊脂糖液體轉(zhuǎn)移入冰上放置的培養(yǎng)皿中的模具中。瓊脂糖會立即固化。第11步和第12步一定要完成的越快越好（15秒以內(nèi)），否則瓊脂糖會在槍頭中固化，造成樣本的損失。避免引入氣泡，但少量的氣泡可能無法避免。
13. 在倒置顯微鏡檢查瓊脂糖包埋的類器官的數(shù)量，質(zhì)量和位置。
14. 在4度孵育1個小時以上，確保瓊脂糖固化完成。
15. 從模具中取出，轉(zhuǎn)移到組織盒中，使用70% 乙醇儲存。
hPSC-Derived Hindgut Spheroid, EPCAM (Green), CDX2 (Red), E-Cad (white), DAPI (Blue)
補液，抗原修復(fù)和染色
補液（Rehydration）
1. 把切片放入接近沸騰的熱水中加熱11分鐘。（切片應(yīng)放入切片盒內(nèi)，且保持干燥。）
2. 使用組織級別的二甲苯里清洗2分鐘。重復(fù)4遍。
3. 使用100% 乙醇清洗5分鐘。重復(fù)2遍。
4. 使用90% 乙醇清洗5分鐘。
5. 使用70% 乙醇里清洗5分鐘。
6. 使用dH2O清洗5分鐘。
注意：
- 免疫熒光染色（Immunofluorescent staining ），請繼續(xù)進行第7-18 步
- H&E 染色（H&E staining ），請繼續(xù)進行第19-24步
- 阿爾新藍染色（ Alcian Blue staining），請繼續(xù)進行第25-32步。
抗原修復(fù)
7. 將切片放入密封的切片盒中。使用微波爐將檸檬酸鹽緩沖液（10 mM 檸檬酸鈉，0.05% tween-20，pH 6.0）加熱至沸騰。用緩沖液加滿切片盒，沒過所有的切片。
8. 將放有切片的切片盒和緩沖液置于蒸器中30分鐘。（需要保持溫度接近沸點，而不要到達沸點。）
9. 將切片從檸檬酸鈉緩沖液中取出，短暫降溫，然后用PBS緩沖液清洗2分鐘。
染色（免疫熒光）
10. 晾干切片，使用免疫組化筆標出類器官切片的部分。
11. 使用適合的封閉緩沖液在室溫封閉1小時（或按照常用的封閉方法進行封閉）。
12. 加一抗，室溫孵育2小時，或在4度孵育過夜。
13. 用PBS清洗2次，每次2分鐘。
14. 加二抗，室溫孵育1小時。避光。
15. 用PBS清洗兩遍，用dH2O清洗一遍。每次2分鐘，晾干。
16. 在每個切片上加一滴含DAPI的ProLong® Gold防猝滅封固劑，輕輕覆蓋一片蓋玻片。用一個200 µL槍頭輕壓蓋玻片，壓出氣泡。靜置10-15分鐘。
17. 使用透明的指甲油封上載玻片，晾干15分鐘。
18. 使用熒光顯微鏡觀察。
染色（H&E）
19. 把類器官部分放在haematoxylin里5分鐘，然后使用自來水清洗1分鐘 。
20. 對類器官切片進行染色（如蘇木精染色），可以用碳酸鋰或“Scott’s tap water” 染色1分鐘，然后用自來水清洗一分鐘。
21. 將切片放在1% acid alcohol里30秒，用自來水清洗1分鐘。
22. 把切片放入eosin（伊紅）內(nèi)染色5分鐘，用自來水請洗1分鐘。
23. 脫水：使用95% 乙醇脫水10分鐘×2。使用100% 乙醇脫水3分鐘×2。使用二甲苯脫水5分鐘×3。
24. 使用封固劑將切片固定，用指甲油密封。
染色（阿爾新藍）
a) 3% 醋酸溶液：冰醋酸 3 mL，dH2O 97 mL
b) 阿爾新藍溶液（Alcian Blue solution） pH 2.5：dH2O 97 mL，3% 醋酸溶液 3 mL，阿爾新藍 （Alcian Blue）1 g，使用蒸餾水溶解染料，加酸攪勻。用醋酸溶液來調(diào)整pH，過濾*。避光保存。
*使用阿爾新藍溶液（Alcian Blue） 前一定要過濾
c) 0.1% 核固紅
25. 將切片放入3% 醋酸溶液3分鐘（用來當媒染劑）。
26. 使用過濾后的阿爾新藍溶液（Alcian Blue） pH 2.5室溫染色30分鐘。
27. 使用自來水清洗2分鐘。
28. 用蒸餾水沖洗。
29. 使用0.1% 核固紅復(fù)染2到5分鐘。
30. 用自來水沖洗2分鐘。
31. 使用二甲苯脫水，清洗
70% 乙醇 - 2分鐘
95% 乙醇 - 2分鐘×2
100% 乙醇 - 2分鐘×2
二甲苯 - 3分鐘×2
32. 使用合成永久性封固劑固定切片。這個步驟需在通風柜內(nèi)完成。固定前，把切片置于二甲苯中。保持濕潤。切片上有二甲苯有利于封固劑的固定。
注意：使用不同pH的阿爾新藍（ Alcian Blue）可檢測更酸性或更硫酸化粘蛋白（sulfated mucins）。但若要檢測這些蛋白，需使用不同的酸進行溶解。
阿爾新藍（Alcian Blue）pH 1.0：使用90 mL的蒸餾水里和10 mL的1N鹽酸（hydrochloric acid）溶解1g的阿爾新藍（Alcian Blue）。
配制1N鹽酸：蒸餾水 915 mL，濃鹽酸（concentrated hydrochloric acid) 85 mL
阿爾新藍 （Alcian Blue） pH 0.2：使用100 mL的10% 硫酸（sulphuric acid）溶解把1 g的阿爾新藍（Alcian Blue）
配制10% 硫酸溶液：蒸餾水 90 mL，濃硫酸 10 mL
當使用強酸染料溶液時，將復(fù)染核固紅之前的清洗改為排酸并用紙吸干。
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