大腸桿菌的檢驗方法
大腸桿菌的檢驗方法！
SN 0169-1992 出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗方法
GB/T 4789.6-2003 食品衛(wèi)生微生物學檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗
GB/T 4789.6-1994 食品衛(wèi)生微生物學檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗（已經作廢）
以SN標準方法為例，進行說明。
樣品制備：
以無菌操作取25 g樣品,放入裝有225 mL稀釋劑的滅菌均質杯內,于8000 r/min均質1～2min,制成1:10樣品勻液(也可用滅菌乳缽研磨的方法代替)。
稀釋樣品勻液根據對樣品污染情況的估計,用稀釋劑將樣品勻液制成一系列十倍遞增的樣品稀釋液,如10**-2、10**-3、10**-4……。從制備樣品勻液至稀釋完畢,全過程不得超過15min。
附：這是一種9管MPN法測定方法，什么是MPN法？
LST和EC初步篩選：
對每個樣品,選擇適宜的三個連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液。每個稀釋度接種三管月桂基硫酸鹽胰蛋白(月示)(LST)肉湯,每管接種1mL。將接種管置于36±1℃培養(yǎng)48±2h。
觀察試管的產氣情況：檢查倒管內是否有氣泡產生,用直徑為3mm的接種環(huán)將所有48±2h內產氣的LST肉湯管培養(yǎng)物移種于EC肉湯管中。將所有接種的EC肉湯管在30min內放入帶蓋44.5±0.5℃水浴箱內,培養(yǎng)48±2h。
附：LST肉湯、EC肉湯有些什么？
EMB平板：
取其產氣管的培養(yǎng)物劃線接種于伊紅美藍(EMB)平板,36±1℃培養(yǎng)24±2h。
檢查平板上有無具黑色中心有光澤或無光澤的典型菌落。
如有典型菌落,則從每個平板上至少挑取2個典型菌落；如無典型菌落,則從每個平板上至少挑取2個可疑菌落。用接種針接觸菌落中心部位,移種到營養(yǎng)瓊脂斜面上,36±1℃培養(yǎng)18～24h。
附：怎樣進行平板劃線分離？
平板劃線示例
EMB平板原理及照片
生化試驗：
將斜面培養(yǎng)物移種到下列培養(yǎng)基中進行生化試驗�！ �
⒈色氨酸肉湯：在36±1℃培養(yǎng)24±2h后,加Kovacs氏試劑0.2～0.3mL,上層出現(xiàn)紅色為靛基質陽性反應。
附：靛基質試驗原理及照片
⒉MR-VP培養(yǎng)基：在36±1℃培養(yǎng)48±2h。以無菌操作移取培養(yǎng)物1 mL至13mm×100mm試管中,加5％α-萘酚乙醇溶液0.6mL,40％氫氧化鉀溶液0.2mL和少許肌酸結晶,振搖試管后靜置2h,如出現(xiàn)伊紅色,為VP試驗陽性。
將MR-VP培養(yǎng)物的剩余部分再培養(yǎng)48h滴加5 滴甲基紅溶液。如培養(yǎng)物變紅色,為甲基紅試驗陽性,若變黃色則為陰性反應。
附：MR-VP試驗原理及照片
⒊Koser氏枸椽酸鹽肉湯：于36±1℃培養(yǎng)96h記錄有無生長。
附：枸椽酸鹽利用試驗原理及斜面顯色照片
⒋ LST肉湯：于36±1℃培養(yǎng)48±2h,觀察試管中是否產氣。
⒌革蘭氏染色：取18h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物作革蘭氏染色。大腸桿菌為革蘭氏陰性。
大腸桿菌與非大腸桿菌生化鑒別如下：
━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━━━━
靛 基 質┃ MR ┃ VP ┃ 枸椽酸鹽 ┃ 鑒定(型別)
━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━
�。々А � ＋ ┃ �。� ┃ �。� ┃典型大腸桿菌
－ ┃ �。� ┃ － ┃ �。� ┃非典型大腸桿菌
━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━
＋ ┃ ＋ ┃ － ┃ �。� ┃典型中間型
�。々А � ＋ ┃ － ┃ �。 � ┃非典型中間型
━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━
－ ┃ － ┃ ＋ ┃ ＋ ┃典型產氣腸桿菌
�。々А � － ┃ ＋ ┃ �。� ┃非典型產氣腸桿菌
━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━━━━
如出現(xiàn)上表以外的生化反應類型,表明培養(yǎng)物可能不純,應重新劃線分離,必要時做
重復試驗。
結果報告：
大腸桿菌為革蘭氏陰性無芽孢桿菌,發(fā)酵乳糖產酸產氣,IMViC試驗為＋＋－－或－＋－－,再根據LST肉湯陽性管數(shù)查MPN表,報告每克(毫升)樣品中大腸桿菌MPN值。
SN 0169-1992 出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗方法
GB/T 4789.6-2003 食品衛(wèi)生微生物學檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗
GB/T 4789.6-1994 食品衛(wèi)生微生物學檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗（已經作廢）
以SN標準方法為例，進行說明。
樣品制備：
以無菌操作取25 g樣品,放入裝有225 mL稀釋劑的滅菌均質杯內,于8000 r/min均質1～2min,制成1:10樣品勻液(也可用滅菌乳缽研磨的方法代替)。
稀釋樣品勻液根據對樣品污染情況的估計,用稀釋劑將樣品勻液制成一系列十倍遞增的樣品稀釋液,如10**-2、10**-3、10**-4……。從制備樣品勻液至稀釋完畢,全過程不得超過15min。
附：這是一種9管MPN法測定方法，什么是MPN法？
LST和EC初步篩選：
對每個樣品,選擇適宜的三個連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液。每個稀釋度接種三管月桂基硫酸鹽胰蛋白(月示)(LST)肉湯,每管接種1mL。將接種管置于36±1℃培養(yǎng)48±2h。
觀察試管的產氣情況：檢查倒管內是否有氣泡產生,用直徑為3mm的接種環(huán)將所有48±2h內產氣的LST肉湯管培養(yǎng)物移種于EC肉湯管中。將所有接種的EC肉湯管在30min內放入帶蓋44.5±0.5℃水浴箱內,培養(yǎng)48±2h。
附：LST肉湯、EC肉湯有些什么？
EMB平板：
取其產氣管的培養(yǎng)物劃線接種于伊紅美藍(EMB)平板,36±1℃培養(yǎng)24±2h。
檢查平板上有無具黑色中心有光澤或無光澤的典型菌落。
如有典型菌落,則從每個平板上至少挑取2個典型菌落；如無典型菌落,則從每個平板上至少挑取2個可疑菌落。用接種針接觸菌落中心部位,移種到營養(yǎng)瓊脂斜面上,36±1℃培養(yǎng)18～24h。
附：怎樣進行平板劃線分離？
平板劃線示例
EMB平板原理及照片
生化試驗：
將斜面培養(yǎng)物移種到下列培養(yǎng)基中進行生化試驗�！ �
⒈色氨酸肉湯：在36±1℃培養(yǎng)24±2h后,加Kovacs氏試劑0.2～0.3mL,上層出現(xiàn)紅色為靛基質陽性反應。
附：靛基質試驗原理及照片
⒉MR-VP培養(yǎng)基：在36±1℃培養(yǎng)48±2h。以無菌操作移取培養(yǎng)物1 mL至13mm×100mm試管中,加5％α-萘酚乙醇溶液0.6mL,40％氫氧化鉀溶液0.2mL和少許肌酸結晶,振搖試管后靜置2h,如出現(xiàn)伊紅色,為VP試驗陽性。
將MR-VP培養(yǎng)物的剩余部分再培養(yǎng)48h滴加5 滴甲基紅溶液。如培養(yǎng)物變紅色,為甲基紅試驗陽性,若變黃色則為陰性反應。
附：MR-VP試驗原理及照片
⒊Koser氏枸椽酸鹽肉湯：于36±1℃培養(yǎng)96h記錄有無生長。
附：枸椽酸鹽利用試驗原理及斜面顯色照片
⒋ LST肉湯：于36±1℃培養(yǎng)48±2h,觀察試管中是否產氣。
⒌革蘭氏染色：取18h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物作革蘭氏染色。大腸桿菌為革蘭氏陰性。
大腸桿菌與非大腸桿菌生化鑒別如下：
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靛 基 質┃ MR ┃ VP ┃ 枸椽酸鹽 ┃ 鑒定(型別)
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�。々А � ＋ ┃ �。� ┃ �。� ┃典型大腸桿菌
－ ┃ �。� ┃ － ┃ �。� ┃非典型大腸桿菌
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＋ ┃ ＋ ┃ － ┃ �。� ┃典型中間型
�。々А � ＋ ┃ － ┃ �。 � ┃非典型中間型
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－ ┃ － ┃ ＋ ┃ ＋ ┃典型產氣腸桿菌
�。々А � － ┃ ＋ ┃ �。� ┃非典型產氣腸桿菌
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如出現(xiàn)上表以外的生化反應類型,表明培養(yǎng)物可能不純,應重新劃線分離,必要時做
重復試驗。
結果報告：
大腸桿菌為革蘭氏陰性無芽孢桿菌,發(fā)酵乳糖產酸產氣,IMViC試驗為＋＋－－或－＋－－,再根據LST肉湯陽性管數(shù)查MPN表,報告每克(毫升)樣品中大腸桿菌MPN值。
