金黃色葡萄球菌的檢測方法！
 
金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus ) 是人類的一種重要病原菌，隸屬于葡萄球菌屬（Staphylococcus），有“嗜肉菌"的別稱，是革蘭氏陽性菌的代表，可引起許多嚴(yán)重感染。而對于金黃色葡萄球菌在速凍食品中的存在量，衛(wèi)生部于2011年11月24日公布食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)《速凍面米制品》，允許金葡菌限量存在。今天我們主要來了解一下它的檢測方法。

一、材料與方法
1、材料
①培養(yǎng)基：7.5%NaCl肉湯培養(yǎng)基，血瓊脂平板培養(yǎng)基（按常規(guī)方法制作）
②試劑：7.5%NaCl肉湯培養(yǎng)基，革蘭氏染色，血瓊脂平板，Baird-Parker瓊脂平板，生理鹽水，兔血漿（1：4）
③器材：溫箱，顯微鏡，天平，均質(zhì)器，載玻片，L型涂片棒，三角瓶，刻度吸管，平皿，試管及試管架，研磨，1ml注射器，
④實驗動物：健康的小白鼠
2、方法
待檢樣品25g+225ml 滅菌生理鹽水
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　　直接計數(shù)法 增菌培養(yǎng)方法
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　　Baird-Parker瓊脂平板 7.5%NaCl肉湯培養(yǎng)基
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　　血平板 血平板
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　　涂片染色鏡 溶血觀察　動物接種試驗 血漿凝固試驗
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　　報告

二、實驗步驟
1、樣品的采集
稱取25g火腿腸，切碎攪勻（用滅菌研缽研磨），置于250ml 錐形瓶中，加入225ml 滅菌生理鹽水，制成1：10樣品混懸液，混勻后作用20分鐘，隨機(jī)取10ml 離心。
2、增菌及分離培養(yǎng)
①增菌培養(yǎng)方法：吸取5ml上清液，接種于7.5%NaCl肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，置于（37±1℃）恒溫箱中培養(yǎng)24h，劃線接種入血平板，（37±1℃）恒溫箱中培養(yǎng)24h。
②直接計數(shù)方法：吸取上述懸液，進(jìn)行10倍遞增稀釋，根據(jù)樣品污染情況，選擇不同濃度的稀釋液各1ml，分別加入3個Baird-Parker瓊脂平板，每個平板的接種量分別為0.3ml、0.3ml、0.4ml。用滅菌L型涂布棒涂布整個平板，置于（37±1℃）恒溫箱中培養(yǎng)24h。之后分別對3個平板上生長的周圍有渾濁帶的黑色菌落進(jìn)行計數(shù)。轉(zhuǎn)接入血平板，（37±1℃）恒溫箱中培養(yǎng)24h。
3、涂片、染色與鏡檢
將純培養(yǎng)的未知菌涂片，革蘭氏染色，顯微鏡觀察。
4、生化實驗
①觸酶試驗
在載玻片上滴1滴3%的過氧化氫，調(diào)取純化的細(xì)菌放在過氧化氫中觀察變化。30s內(nèi)產(chǎn)生大量氣泡者為陽性，不產(chǎn)生氣泡者為陰性。
②血漿凝固酶試驗
吸取1：4新鮮兔血漿0.5ml，放入小試管中，再加入培養(yǎng)24h的2①中的肉湯培養(yǎng)液0.5ml，搖蕩均勻，放入（37±1℃）恒溫箱中培養(yǎng)，每0.5h觀察一次，觀察6h，檢查是否出現(xiàn)凝固。將試管傾斜或倒置時，呈現(xiàn)凝塊狀，可判定為陽性，同時以已知陽性葡糖球菌和陰性肉湯作為對照。
5、動物感染實驗
用無菌生理鹽水將2①中血瓊脂板上純化的菌落洗下后，以0.5ml/只腹腔注射入小白鼠體內(nèi)，同時用滅菌生理鹽水注射入另外的小白鼠體內(nèi)，以做對照，分別在相同條件飼養(yǎng)，觀察其癥狀。對感染試驗出現(xiàn)癥狀或死亡的小白鼠進(jìn)行剖檢，并采集病料，進(jìn)行分離。

三、結(jié)果與分析
1、培養(yǎng)特性及形態(tài)特征
①培養(yǎng)特性
在37℃條件下，需氧與厭氧培養(yǎng)的血液營養(yǎng)瓊脂平板均長出光滑、濕潤、隆起，約1mm大小的金黃色菌落，并且有β溶血現(xiàn)象。
②鏡檢結(jié)果
顯微鏡下觀察該菌為革蘭氏陽性球菌，排列成葡萄串狀，也有個別2個或3個球菌相連。根據(jù)菌落形態(tài)、鏡檢結(jié)果懷疑該菌為葡萄球菌。
2、菌落計數(shù)報告
將直接計數(shù)法試驗中的3個平板中疑似黑色葡萄球菌的金黃色菌落數(shù)相加，乘以血漿凝固酶試驗陽性數(shù)，除以5，在乘以稀釋倍數(shù)，即為每克樣品中金黃色葡萄球菌數(shù)量。
3、動物感染試驗
只注生理鹽水的小白鼠沒有任何變化：接種分離菌的小白鼠在9h內(nèi)死亡。將死亡的小白鼠剖檢采集病料，進(jìn)行細(xì)菌分離和生化試驗，得到與原分離菌。
“金球菌”列為“極重要質(zhì)量項目”
金黃色葡萄球菌因思念、三全、灣仔碼頭事件而引發(fā)標(biāo)準(zhǔn)爭議，在2011年12月21日實施的速凍食品新國標(biāo)中，金黃色葡萄球菌從原來“不得檢出”變?yōu)?ldquo;限量檢出”，但這一檢測標(biāo)準(zhǔn)的改變并不代表可以忽略金黃色葡萄球菌的危害性。
在市質(zhì)監(jiān)局征集意見而公示的抽檢項目中查詢到，對包括速凍水餃、湯圓、包子、花卷、饅頭、南瓜餅、八寶飯等在內(nèi)的速凍米面食品，仍然計劃把金黃色葡萄球菌列入A類檢驗項目，并標(biāo)注為“極重要質(zhì)量項目”，同時速凍米面食品的沙門氏菌也是A類檢驗。
速凍食品“金球菌”可限量檢出
中國現(xiàn)行《速凍預(yù)包裝面米食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB19295－2003）規(guī)定金黃色葡萄球菌等致病菌不得檢出。
而衛(wèi)生部于2012年12月21日實施的《速凍面米制品食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)》，將金黃色葡萄球菌檢測由定性轉(zhuǎn)向定量，規(guī)定每批產(chǎn)品抽檢5個樣品中，至多只能有1個樣品每克生制品中檢出的金黃色葡萄球菌含量在1000至10000個之間。 

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