圖1. 基因編輯示意圖^[1]
 

研究歷史

20世紀(jì)80年代初，胚胎干細(xì)胞分離和體外培養(yǎng)的成功為基因敲除奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。1985年，首次證實(shí)的哺乳動物細(xì)胞中同源重組(homology recombination, HR)的存在為基因敲除奠定了理論基礎(chǔ)^[2]。為了編輯基因，傳統(tǒng)的靶向特定等位基因的同源重組技術(shù)被使用，但是，這個方法在當(dāng)年來說，存在效率低、勞動成本高的缺點(diǎn)，嚴(yán)重制約了基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用，這就需要科學(xué)家探索更為簡潔高效的基因編輯技術(shù)。

為了實(shí)現(xiàn)利用簡單的方法使特定基因失去功能，科學(xué)家研發(fā)出了RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)，希望更易于研究哺乳動物細(xì)胞的基因功能，它具有操作簡單、效果明顯等優(yōu)點(diǎn)。但RNAi不能作用于所有基因和某些細(xì)胞類型(如神經(jīng)元)，而且存在位置效應(yīng)、臨時性和不完全敲除的缺點(diǎn)^[3]。

隨著各種基因編輯技術(shù)的進(jìn)步，如：鋅指核酸酶技術(shù)(zinc finger nuclease，ZFN)^[4]、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)物核酸酶技術(shù)(transcription activator-like effector nucleases，TALENs)^[5]和成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列系統(tǒng)(clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR -associated (Cas) 9 system，CRISPR/Cas9)^[6]等技術(shù)技術(shù)更迭，基因編輯領(lǐng)域也發(fā)生了革命性的改變。

今天小編就帶大家重新進(jìn)入一下CRISPR/Cas9 技術(shù)和RNA干擾的世界吧，一起來回顧歷史哦~

 

圖2.http://www.sohu.com/a/284394775_704327^[7]

 

CRISPR/Cas9基因敲除

基因敲除(knockout)是指利用遺傳工程技術(shù)，針對某個特定已知基因序列，改變生物的遺傳基因，令其功能喪失作用，并進(jìn)一步對生物體造成影響，進(jìn)而推測出該基因的生物學(xué)功能。CRISPR/Cas9 是近年來發(fā)展最快的新基因敲除技術(shù)，它廣泛存在于許多原核生物基因組中，其中的域型CRISPR/Cas9 系統(tǒng)可以依賴Cas9內(nèi)切酶家族靶向剪切外源 DNA。轉(zhuǎn)錄后，每個crRNA (CRISPR RNA)和 tracrRNA (trans-activating crRNA)結(jié)合在一起，并和Cas9核酸酶形成一個復(fù)合物^[3]。Cas9核酸酶在crRNA 的指引下，識別保守的間隔相鄰基序(protospacer adjacent motif，PAM)并靶向結(jié)合到 DNA 上，從而切割 DNA。這個技術(shù)操作簡單快捷、成本低廉、脫靶效應(yīng)較低，已經(jīng)成為基因功能研究領(lǐng)域強(qiáng)有力的武器，極大地加速了藥物靶點(diǎn)的篩選驗(yàn)證及新藥的研發(fā)。

 

圖3. CRISPR/Cas9技術(shù)工作示意圖^[8]

 

RNA干擾

RNA干擾是指小分子雙鏈RNA可以特異性地降解或抑制同源mRNA表達(dá)，從而抑制或關(guān)閉特定基因表達(dá)的現(xiàn)象，其主要是通過短干擾RNA (short interfering RNA，siRNA)和短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)來調(diào)節(jié)基因表達(dá)^[9]。dsRNA在Dicer 酶的作用下可產(chǎn)生一系列長度為21~22 nt的siRNAs，后者在細(xì)胞內(nèi) RNA 解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，隨后由反義siRNA再與體內(nèi)一些酶(包括內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等)結(jié)合形成 RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。具有核酸酶功能的RISC與外源性基因表達(dá)的mRNA同源區(qū)進(jìn)行特異性結(jié)合，在結(jié)合部位切割 mRNA。被切割后的斷裂mRNA隨即降解，從而誘發(fā)宿主細(xì)胞針對這些mRNA的降解反應(yīng)，封閉內(nèi)源性基因的表達(dá)，使該基因失活，最終達(dá)到基因沉默的作用^[3]。

圖4. RNA干擾的示意圖^[10]

 

CRISPR/Cas9基因敲除與RNA干擾優(yōu)勢對比

就目前來說，CRISPR/Cas9 技術(shù)的效率已經(jīng)非常高，基本可以在經(jīng)過一次打靶過程就可以得到基因敲除的小鼠，而傳統(tǒng)的基于同源重組的技術(shù)則需要更長的時間。基于CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)其成本低、制作簡便、快捷高效的優(yōu)點(diǎn)，讓它迅速風(fēng)靡于世界各地的實(shí)驗(yàn)室，成為科研、醫(yī)療等領(lǐng)域的有效工具，更被認(rèn)為能夠在活細(xì)胞中最有效、最便捷地“編輯”任何基因；作為一種新型的靶向基因編輯技術(shù)，CRISPR/Cas9 技術(shù)已成功在斑馬魚、小鼠和大鼠等多個物種中得到了廣泛應(yīng)用，此外該項(xiàng)技術(shù)不存在動物物種的限制，其在植物基因修飾中也取得了突破，如大豆、煙草、水稻和小麥中都取得了成功。

CRISPR 技術(shù)的優(yōu)勢是能永久性地改變基因組DNA的序列，但在基因沉默方面RNAi 技術(shù)也有其獨(dú)特的優(yōu)勢。具體來說首先RNAi無需引入額外的蛋白質(zhì)因子，更安全，成本更低；其次RNAi 是一種轉(zhuǎn)錄后水平的可逆的基因沉默技術(shù)，只需通過siRNA的添加與否，或使用小分子化合物調(diào)控siRNA表達(dá)載體上誘導(dǎo)型啟動子的活性就能實(shí)現(xiàn)對靶基因的沉默與開啟；最后RNAi在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，故設(shè)計siRNA時只需參考轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)^[11]。

應(yīng)用

1、CRISPR/Cas9基因敲除

CRISPR/Cas9技術(shù)在藥物研發(fā)的功能基因篩選過程中，只需要將一個sgRNAs文庫導(dǎo)入細(xì)胞中，再通過相關(guān)表型的評估，即可實(shí)現(xiàn)對基因組的大規(guī)模定點(diǎn)編輯和篩選，進(jìn)而揭示基因的生理功能，為新藥研發(fā)提供可靠的靶標(biāo)。

CRISPR/Cas9技術(shù)不僅僅限于基因敲除，包括大片段的敲進(jìn)，點(diǎn)突變，人源化替換等策略都已經(jīng)在動物模型構(gòu)建中已大展身手，大大縮減了構(gòu)建動物模型的時間和經(jīng)費(fèi)。而且已廣泛應(yīng)用于各種的基因編輯模型構(gòu)建（主要包括腫瘤和干細(xì)胞系）。此外該技術(shù)應(yīng)用于人體的基因治療也在快速發(fā)展過程中，將為人類疾病的治療帶來巨大的幫助^[12]。

2、RNA干擾

① 基因功能研究

由于RNAi具有很好的特異性和有效的干擾活力，可以使特定基因沉默，使其功能喪失或降低表達(dá)，因此可以作為功能基因組學(xué)的一種強(qiáng)有力的研究工具^[9]。已有研究表明siRNA能夠在哺乳動物中抑制特定基因的表達(dá)，而且抑制基因表達(dá)的時間可以控制在發(fā)育的任何階段，產(chǎn)生類似的基因敲除的效應(yīng)。

② 病毒性疾病的治療

研究表明，人們通過合成一段針對特定病毒基因的siRNA，并將之導(dǎo)入該病毒感染的細(xì)胞，能夠有效地抑制該病毒的復(fù)制，阻斷病毒對細(xì)胞的感染。并且，可貴的是，siRNA在病毒感染的早期就能發(fā)揮抑制作用。因而，siRNA可用來治療病毒性疾病。

③ 腫瘤病的治療

腫瘤是多個基因相互作用的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的結(jié)果，傳統(tǒng)技術(shù)誘發(fā)的單一癌基因的阻斷不可能完全抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤的生長，而RNAi可以利用同一基因家族的多個基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性，設(shè)計針對這一區(qū)段序列的siRNA分子，只注射一種siRNA即可產(chǎn)生多個基因同時剔除的效果，也可以同時注射多種siRNA而將多個序列不相關(guān)的基因同時剔除。

總結(jié)

綜上所述，在基因編輯技術(shù)中，基因敲除技術(shù)與RNAi技術(shù)各有千秋，都被積極地應(yīng)用于一些生物問題的研究，包括一些人類疾病，極大地滿足了研究人員操作不同類型基因組的目的，不僅可以作為基因編輯的工具，也可用于基因表達(dá)調(diào)控。這就好比“寶刀屠龍，號令天下；倚天不出，誰與爭鋒”。

今天的干貨就暫時到這里啦，各位寶寶們是不是墨水滿滿的呢，咳咳，如果感興趣，一定要隨時關(guān)注留意小編，定不會錯過你想要的，咱們下次再會~小編悄悄地來，又輕輕地走，不要帶走任何遺憾哦

參考資料

[1]https://www.cnblogs.com/pythonicanus/p/10111230.html

[2]Smithies O, Gregg R G, Boggs S S, et al. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal β-globin locus by homologous recombination[J]. Nature, 1985, 317(6034): 230-234.

[3]李 妤，趙紅業(yè)，崔 勇，魏紅江，李梅章. 基因編輯技術(shù)的研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)研究，2017，21(3)

[4]Hauschild-Quintern J, Petersen B, Cost G J, et al. Gene knockout and knockin by zinc-finger nucleases: current status and perspectives[J]. Cellular and Molecular Life Sciences, 2013, 70(16): 2969-2983.

[5]Cermak T, Doyle E L, Christian M, et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting[J]. Nucleic Acids Research, 2011, 39(12): e82.

[6]Cong L, Ran F A, Cox D, et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems[J]. Science, 2013, 339(6121): 819-823

[7]http://www.sohu.com/a/284394775_704327

[8]https://www.iiiff.com/article/24961

[9]Wilson R C, Doudna J A. Molecular mechanisms of RNA interference[J]. Annual Review of Biophysics, 2013, 42: 217-239

[10]http://blog.sina.com.cn/s/blog_445dac3b0102x8kb.html

[11]尚仁福，吳立剛. RNA干擾的機(jī)制及其應(yīng)用[J]. 生命科學(xué)，2016，28(5)