作者
Chava Pocernich，Jolita Uthe，Steve Siembieda 安捷倫科技有限公司

摘要
核酸樣品的質量保證和質量控制對于生物樣本庫和進行基因組相關操作的實驗室以及多種分子生物學應用必不可少。革命性的 Agilent Femto Pulse 系統(tǒng)是唯一一款能夠替代脈沖場凝膠電泳分析高分子量 (HMW) gDNA 的儀器。Femto Pulse 系統(tǒng)為研究人員提供了極高的靈敏度和快速的分離時間，能夠在 70 分鐘內對單個細胞量的 gDNA 進行定量和鑒定。安捷倫基因組 DNA 165 kb 試劑盒設計用于分離 HMW gDNA，可實現可重現的分子量測定、定量分析和基于基因組質量值 (GQN) 的質量控制評估。

前言
DNA 完整性的表征對于生物樣本庫質量控制評估至關重要。了解基因組 DNA (gDNA) 質量是 DNA 完整性的獨特價值， 并對下游過程的成功必不可少。隨著人們對長讀長和全基因組測序技術、比較基因組雜交以及使用 linked reads 的序列組裝技術的興趣日益增加，了解 gDNA 質量、片段化、分子量分布和濃度成為了成功獲得結果的必要條件。

通過確定樣品的片段化和降解程度，部分評估 gDNA 質量。影響樣品質量的幾個因素有：樣品儲存、提取方法、反復凍融和變性^[1]。在提取和處理 gDNA 期間，DNA 可以在許多不同位點發(fā)生物理、酶促和化學剪切，變?yōu)樾∑�段。物理剪切發(fā)生在長時間的劇烈混合條件下，以及反復凍融和冰晶形成期間。DNA 周圍細胞環(huán)境的破壞將通過自由基氧化、脫嘌呤和 gDNA 的核酸酶降解引發(fā)酶促和化學剪切，導致一系列短片段的生成。在使用高強度化學品提取 DNA 時也可能發(fā)生化學剪切。用大口徑移液槍頭緩慢混合可以防止 gDNA 物理剪切，而通過冷凍、脫水或添加螯合劑（如 EDTA）可避免化學和酶促剪切過程�？紤]到 DNA 完整性會以多種方式發(fā)生改變，建議在長期儲存 gDNA 樣品之前記錄核酸質量。

通常用過夜脈沖場凝膠電泳 (PFGE) 分析分子量超過 50 kb 的 gDNA。配備安捷倫基因組 DNA 165 kb 試劑盒的 Agilent Femto Pulse 系統(tǒng)是市場上唯一能夠替代 PFGE 評估高分子量 (HMW) gDNA 的解決方案。分離過程在短短 70 分鐘內完成，節(jié)省了確定樣品質量所需的時間和金錢^[2]。此外，安捷倫設計的 ProSize 數據分析軟件可以通過基因組質量值輕松分析 gDNA  質量。用戶可針對其特定應用設定合適的分子量閾值。然后，ProSize 根據高于分子量閾值的樣品總測量濃度分數計算 GQN 值。GQN 以 0 到 10 的等級對樣品進行評分，0 表示樣品均未超過分子量閾值，10 表示 100% 的樣品高于分子量閾值。

實驗部分
在配備基因組 DNA 165 kb 試劑盒 (FP- 1002-0275) 的兩臺不同 Femto Pulse 系統(tǒng)上分離 40 號（gDNA 樣品 1）和 92 號（gDNA 樣品 2）Coriell 樣品，以證明儀器間一致性以及隨時間推移的降解程度。在配備安捷倫基因組 DNA 165 kb 試劑盒的 Femto Pulse 系統(tǒng)上對來自 PacBio 的剪切 gDNA 進行分離，以展示 GQN 指標的靈活性。在配備基因組 DNA 165 kb 試劑盒的 Femto Pulse 系統(tǒng)上對 Promega 人 gDNA (#G1521) 進行分離，以顯示峰大小和特征片段長度。

結果與討論
分子量測定
Femto Pulse 系統(tǒng)利用脈沖場方法分離高分子量 gDNA，用于確定大于 50 kb 的 gDNA 的平均分子量。此外，電泳圖提供了直觀的樣品分子量分布圖。在不使用脈沖場方法的情況下，大于約 50 kb 的樣品顯示為尖峰且測定分子量超過 60 kb。在配備基因組 DNA 165 kb 試劑盒的 Femto Pulse 系統(tǒng)上分析 gDNA 樣品 1，彌散條帶平均分子量為 44800 bp，分布在 1200 到 300000 bp 之間（圖 1）。



儀器間的一致性
在配備安捷倫基因組 DNA 165 kb 試劑盒的 Femto Pulse 系統(tǒng)上分析兩種不同的 gDNA 樣品。在兩臺不同的 Femto Pulse 儀器上對幾種濃度下的兩個樣品進行了分析，以證明較大濃度范圍內不同儀器之間的分子量測定、濃度定量和 gDNA 質量分析的可靠性與一致性（圖 2）。每臺儀器各稀釋比例的分子量測定和定量分析精度（誤差）分別低于 8% 和 16%，均處于試劑盒的規(guī)格范圍內。此外，GQN 證明儀器有極高精度，CV 為 3%。



基因組質量值 (GQN)
GQN 用數值表示 gDNA 質量，代表了高于分子量閾值樣品的比例。高度完整的 gDNA 的分子量會隨包括物種在內的許多因素而變化。因此，在需要分析不同分子量的 gDNA 時，能設置 GQN 分子量閾值是一項巨大的優(yōu)勢。用戶可以根據具體樣品確定分子量閾值，以便客觀判斷哪些樣品可用于下游操作。

根據 gDNA 樣品 A 和 B 的分子量分布， 將 GQN 分子量閾值設定為 10000 bp。GQN 在不同稀釋比例組中保持一致，數值集中在 9.0 至 8.8 之間（圖 2）。GQN 9.0 表示高于 10000 bp 閾值的樣品占90%。也就是說，有 10% 的樣品低于閾值水平。隨著時間的推移，樣品 GQN 的降低表明已經發(fā)生了降解。

在圖 3 中，將剪切 gDNA PacBio 樣品的 GQN 分子量閾值設為 30000 bp，表明評價 gDNA 質量時 GQN 的靈活性。30000 bp 的分子量閾值得到的低分子量樣品的 GQN 值低于高分子量樣品，與GQN 隨分子量不同而變化的預期一致。



降解檢測
Femto Pulse 系統(tǒng)可以檢出輕微程度的降解，并反映在 GQN 中。制備好 gDNA 樣品 1 的樣品板后立即分析，然后在室溫下放置 3 天后再次分析。Femto Pulse 系統(tǒng)分離顯示樣品 1 出現了明顯降解，在原gDNA 條帶前方出現小彌散條帶，平均分子量從 44.8 kb 減小至 34.5 kb（圖 4）。



GQN₁₀₀₀₀ 從 9.1 降至 8.4，也反映出降解的存在。ProSize 還允許用戶在 Smear Analysis 選項卡中選擇堿基對范圍，從而檢測低分子量區(qū)域中的樣品降解百分比。樣品 1 的降解范圍選擇為 200 至 1200 bp。該范圍包括緊鄰原樣品條帶的前方區(qū)域，同時排除了下位內標。室溫環(huán)境放置使降解百分比從 0.1% 升高至 1.4%（圖 4）。這也被稱為“小于 X kb”的彌散條帶比 (SR)^[1]。彌散條帶比提供了因凍融或化學降解而片段化的 DNA 比例估計值。


特征片段長度 (CFL)
特征片段長度 (CFL) 對應于樣品中豐度最高的片段^[3]。在 ProSize 中，將其報告為峰分子量。在用凝膠電泳評估 DNA 完整性時，CFL 是常規(guī)報告參數。CFL 的減少變化容易檢出，并可作為物理剪切引起降解的指標。在配備安捷倫基因組DNA 165 kb 試劑盒的 Femto Pulse 系統(tǒng)上分析 Promega 人 gDNA。電泳圖顯示出 175685 bp 的尖峰，對應為樣品的 CFL（圖 5）。并非所有樣品都能顯示出明確的 CFL，如圖 1 所示。在這種情況下，可以利用平均分子量的變化追蹤降解，而不是用最大豐度峰分子量或CFL。



結論
隨著人們對長讀長和全基因組測序技術的興趣日益增加，HMW gDNA 質量的記錄變得越來越重要。Femto Pulse 系統(tǒng)是唯一一款能夠替代脈沖場凝膠電泳， 在 70 分鐘內分析分子量超過 60 kb 的HMW gDNA 的儀器，檢測限低至單個細胞的 DNA 量。在 Femto Pulse 系統(tǒng)中利用 GQN、平均分子量或特征片段長度變化，以及低分子量彌散條帶區(qū)域的增加， 可輕松對gDNA 降解進行評估。

參考文獻
1. Klingstrom, T.; Bongcam-Rudloff, E.; Pettersson, O. V. A Comprehensive Model of DNA Fragmentation for the Preservation of High Molecular Weight DNA. BioRxiv: The Preprint Server for Biology 2018
2. Pocernich, C.; Uthe, J.; Wong, K-S. Genomic DNA Sizing and Quality Control with the Agilent Femto Pulse System（利用 Agilent Femto Pulse 系統(tǒng)進行基因組DNA 分子量測定與質量控制），安捷倫科技公司應用簡報，出版號 5994-0516EN，2017
3. Cinselli, C. W.; et al. Combining Qualitative and Quantitative Imaging Evaluation for Assessment of Genomic DNA Integrity: The SPIDA Experience. Anal. Biochem. 2015, 479, 60–62

^{僅限研究使用。不可用于診斷目的。
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2019 年 2 月 14 日，中國出版
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