DELFIA經(jīng)典技術應用于單抗研發(fā)及細胞治療——AD0116細胞殺傷專題之ADCC
DELFIA經(jīng)典技術應用于單抗研發(fā)及細胞治療——AD0116細胞殺傷專題之ADCC
ADCC簡介
Fc區(qū)域主要介導以下三類活動：
1. 通過結合表達在Natural killer (NK)等免疫細胞表面上的FcγR（Fcγ receptors）激活抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）
2. 通過結合血清補體C1q激活補體依賴的細胞毒性作用（Complement-dependent?cytotoxicity，CDC）
3. 通過結合新生兒Fc受體（Neonatal Fc receptor ，F(xiàn)cRn）延長抗體半衰期。
今天我們主要關注ADCC，其不僅是機體通過抗體清除被病毒或其他病原物感染細胞的主要途徑，也是目前治療性抗體發(fā)揮臨床效果的（Mechanism of Action ，MOA）核心機制之一[1]。因此，對于抗體新藥研發(fā)和改造，仿制藥開發(fā)和研發(fā)過程中抗體質量及功能的分析，都離不開ADCC的檢測。同時，在生物藥和免疫調節(jié)藥物的臨床試驗中，ADCC活力也是必須的ex vivo指標之一。在此，我們以ADCC檢測為切入點，向大家展示珀金埃爾默的DELFIA技術平臺是如何助力抗體制藥的。
圖片引用自參考資料[1]
基于DELFIA技術的ADCC檢測
從細胞水平來說，ADCC本質上屬于免疫細胞介導的殺傷。因此，常見的針對細胞殺傷（注意不是細胞活力）的檢測方式，如經(jīng)典的51Cr釋放法，LDH檢測，和Calcein 釋放法等都可以用于ADCC檢測。從原理上，這些方法可分為直接的檢測靶細胞在效應免疫細胞作用下的裂解程度，如51Cr釋放法；和間接的檢測效應細胞的活化，如NFAT-RE-luc報告基因法和監(jiān)測剩余的細胞活力來評估細胞殺傷，如化學發(fā)光法等。間接法的缺點是不能直接模擬體內(nèi)ADCC過程。利用DELFIA技術的DELFIA® EuTDA（貨號AD0116）細胞毒法屬于直接檢測法，更能反映ADCC的MOA。與51Cr釋放法形式類似，DELFIA® EuTDA細胞毒法利用熒光放大配體BATDA特異的標記靶細胞。BATDA能迅速進入細胞，并在水解作用下形成親水的TDA留在細胞內(nèi)，并在靶細胞裂解下釋放，和DELIFA Eu試劑相結合形成強熒光、穩(wěn)定的螯合物EuTDA用于檢測。更詳細的原理介紹可參考我們的微信端公眾號[2]和應用材料[3]。
圖片引用自參考資料[3]
作為放射性檢測的替代方法，更為安全的DELFIA® EuTDA細胞毒法在ADCC活力檢測中具有眾多優(yōu)勢。相較于無法區(qū)分非特異死亡的LDH檢測，EuTDA法不受效應細胞死亡和裂解的影響，降低背景的同時提升了檢測的窗口和穩(wěn)定性。相較于Calcein，BATDA能有效標記脆弱細胞，迅速被細胞攝取和在細胞裂解下完成高效的釋放，為ADCC檢測提供了穩(wěn)定的檢測窗口和易于標準化等優(yōu)勢。同時，EuTDA細胞毒法不受效應細胞限制，靈活支持利用多種原代免疫細胞（如PBMC和NK細胞）和更為穩(wěn)定的改造細胞系的ADCC檢測。從檢測模式上EuTDA方法為時間分辨熒光（Time-Resolved Fluorescence，TRF），因此擁有TRF本身的眾多優(yōu)勢，包括不受來源于培養(yǎng)基和血清等的背景熒光干擾，高穩(wěn)定性和重復性等。此外，靶向紅外區(qū)的檢測能有效避免檢測樣本來帶的干擾，并為多重檢測打下基礎。最后，對自動化和小型化的支持已讓EuTDA法逐漸成為大分子藥物研發(fā)中ADCC檢測的標準方法[4]。在此，我們通過幾個經(jīng)典案例向大家介紹基于DELFIA技術的ADCC檢測是如何助力大分子藥物研發(fā)的。
單抗研發(fā)領域之Fc區(qū)域改造
在此，我們向大家介紹抗體改造的先河研究[5]。在結構解析的基礎上，該研究引入AlphaScreen高通量篩選平臺，通過競爭法鑒定出FcγRIIIa高親和力的Fc區(qū)域變體。AlphaScreen的親和力結果進一步由Biacore SPR 確認。除了檢測變體和FcγRIIIa之間的親和力，AlphaScreen還用于確認變體和抑制性IgG受體FcγRIIb之間的親和力，從而獲得變體和RIIIa/RIIb的相對親和力比值。結果顯示A330L 突變和S239D/I332E相結合能提高對激活性FcγRIIIa的親和力的同時降低和抑制性受體FcγRIIb之間的親和力，顯著提升RIIIa/RIIb的相對親和力比值（4->9, 針對Trastuzumab）。
在親和力篩選的基礎上，研究利用DELFIA EuTDA-based cytotoxicity assay（貨號AD0116）在細胞水水平探究變體對ADCC的提升。以不同F(xiàn)cγRIIIa基因型的PBMCs為效應細胞，Her2+ SkBr3為靶細胞，研究證明改造的變體能有效提升ADCC（2-3個數(shù)量級），與親和力數(shù)據(jù)趨勢一致（下圖左）。進一步的研究證明變體能有效引發(fā)針對HER-2不同表達水平的細胞株的ADCC。針對幾乎沒有抗原表達的MCF7細胞系，變體依然具有客觀的ADCC活力（下圖右）。
除了基因水平多態(tài)性外，Fc區(qū)域的糖基化也影響其和FcγR的親和力。尤其是巖藻糖的缺失會提升IgG1和FcγRIIIa之間的親和力。因此，除了突變外，改造Fc區(qū)域的糖基化修飾也是提升治療性抗體ADCC活力的一個途徑。以由羅氏研發(fā)的Lumretuzumab單抗（RG7116）為例[6]。RG7116一方面阻斷HER3的激活并下調HER3的表達。進一步通過羅氏去巖藻糖修飾的GlycoMab技術改造，RG7116和FcγRIIIa之間的結合親和力提高50倍。基于DELFIA技術的ADCC檢測證明，糖基化改造顯著提升RG7116的ADCC活力（下圖左）。同時，對比不同HER3表達量的細胞系，研究清晰地表明HER3受體表達豐度和RG7116介導的ADCC活力之間的正相關聯(lián)系（下圖右）。在動物模型上，基于多種低免疫細胞浸潤的小鼠皮下瘤模型，研究發(fā)現(xiàn)RG7116僅通過靶向HER3就能發(fā)揮抗癌作用。進一步利用高免疫細胞浸潤的異種原位移植A549肺癌小鼠模型，研究證明糖基化改造有效提升小鼠的生存周期。臨床一期試驗進一步證明RG7116的臨床療效。一方面，RG7116有效抑制了腫瘤細胞膜HER3的表達。同時，相較于未糖基化改造的抗體，RG7116升高外周NK免疫細胞的活化程度[7]。
雖然同是單抗藥物，PD-1抑制劑與常見的靶向藥物作用機制不同。PD-1抗體主要用于阻斷PD-1和其配體PD-L1的相互作用，而不是殺傷PD-1陽性細胞，也就是抗腫瘤效應細胞。在Nivolumab的體外表征分析研究中，DELFIA Cell Cytotoxicity Kit（貨號AD0116）被用于確認Nivolumab是否會誘導ADCC產(chǎn)生。以活化的PBMCs為效應細胞，高表達PD-1的CD4陽性細胞為靶細胞，研究人員確認IgG4亞型的nivolumab不會誘發(fā)ADCC效應[8]。后續(xù)的實驗進一步證明nivolumab不能介導CDC，因此nivolumab的引入不會清除PD-1陽性細胞群體。除了nivolumab外，其他的PD-1單抗，包括默沙東的Keytruda、百濟神州的BGB-A317及恒瑞的SHR-1210,都為弱ADCC活性設計。然而，同樣是免疫檢查點抑制劑，CTLA-4單抗Ipilimumab則需要其ADCC活性來殺傷Treg細胞發(fā)揮作用，強調了不同作用機制對抗體ADCC活性的要求也有區(qū)別[9]。
ADCC活力的檢測不僅能協(xié)助解析單抗藥物的MOA，也推動對于NK細胞功能的研究及開辟新的抗腫瘤策略。作為成熟的細胞殺傷檢測工具，DELFIA® EuTDA（貨號AD0116）細胞毒法不僅可用于評估抗體的ADCC和CDC活力，還能用于檢測ACT，CAR-T和CAR-NK等療法中免疫細胞的殺傷能力。為了助力免疫治療的開發(fā)，我們近期推出“珀金埃爾默生命科學試劑耗材平臺”，加速您的研究和藥物開發(fā)進程。
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參考資料
[1] Deyev SM, Lebedenko EN. Modern Technologies for Creating Synthetic Antibodies for Clinical Application.Acta Naturae. 2009 Apr;1(1):32-50.
[2] 科研干貨|免疫細胞如何殺傷腫瘤細胞. https://mp.weixin.qq.com/s/-jW77oFnXusb9h6e-AKQBg
[3] A Simplified, Gentle Cell-Labelling Method for Non-Radioactive Cytotoxicity Assays. PerkinElmer application note
[4] An Automated DELFIA ADCC Assay Method using a CD16.NK-92 Cell Line. Biotek application note
[5] Lazar GA, et al.Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Mar 14;103(11):4005-10.
[6] Mirschberger C, et al. RG7116, a TherapeuticAntibody That Binds the Inactive HER3 Receptor and Is Optimized for Immune Effector Activation. Cancer Res. 2013 Aug 15;73(16):5183-94.
[7] Meulendijks D, et al. First-in-Human Phase I Study of Lumretuzumab, a Glycoengineered Humanized Anti-HER3 Monoclonal Antibody, in Patients with Metastatic or Advanced HER3-Positive Solid Tumors.Clin Cancer Res. 2016 Feb 15;22(4):877-85.
[8] Wang C, et al. In Vitro Characterization of the Anti-PD-1 Antibody Nivolumab, BMS-936558, and In Vivo Toxicology in Non-Human Primates. Cancer Immunol Res. 2014 Sep;2(9):846-56.
[9] Romano E, et al. Ipilimumab-dependent cell-mediated cytotoxicity of regulatory T cells ex vivo by nonclassical monocytes in melanoma patients. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 May 12;112(19):6140-5.
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