選擇合適的色譜柱
 
微粒。通過(guò)與柱內(nèi)填充微粒疏水表面的相互作用實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)與多肽的分離。
柱內(nèi)填充粒通常以硅膠為基礎(chǔ)，這是因?yàn)楣枘z的穩(wěn)定性高，能夠在大多數(shù)溶劑條件下（除了pH大于6.5的情況）保持穩(wěn)定，此外，硅膠可以形成各種大小的具有不同直徑的多孔球形顆粒。

硅膠純度。高效液相色譜柱所用硅膠填料的純度對(duì)分離性能至關(guān)重要。金屬離子雜質(zhì)會(huì)導(dǎo)致峰拖尾和分辨率下降，如圖7A所示（0.01%和0.005%的TFA）。
含金屬離子雜質(zhì)（圖7A）的硅膠需要采用高濃度離子對(duì)試劑（如三氟乙酸（TFA））維持良好的峰形。

 

 

圖7. 硅膠純度會(huì)影響多肽的峰形，尤其是加入的離子對(duì)試劑濃度較低時(shí)。高純度硅膠所需離子對(duì)試劑的濃度遠(yuǎn)比低純度硅膠低。

 

洗脫液：加入如圖所示的TFA，以10%-55%的乙腈（ACN）梯度洗脫，洗脫時(shí)間為37.5分鐘。

低濃度TFA會(huì)導(dǎo)致峰形較差且分辨率下降。硅膠純度較高時(shí)（圖7B），0.005%的低濃度TFA會(huì)產(chǎn)生良好的峰形。這在液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法中尤其重要，因?yàn)樵谑褂秒妵婌F接口時(shí)TFA會(huì)導(dǎo)致信號(hào)減弱。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法中低濃度的TFA會(huì)獲得更好的檢測(cè)信號(hào)。

 

孔徑。通常，反相高效液相色譜法中小孔（~100埃）硅膠分離蛋白質(zhì)的效果較差。大孔硅膠（~300埃直徑）可以更好地分離蛋白質(zhì)（參考文獻(xiàn)4）。
如圖8所示，蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入小孔，只與極小的外表面相互作用實(shí)現(xiàn)分離。
大孔硅膠允許蛋白質(zhì)，甚至更大的多肽進(jìn)入小孔，從而與疏水界面充分作用，因此最終的峰形更好，分辨率更高。如今，大孔硅膠已普遍應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分離中。
由蛋白酶水解等產(chǎn)生的小分子肽能夠進(jìn)入小孔硅膠的孔隙內(nèi)，從而與疏水界面相互作用，因此小孔硅膠也可用于蛋白質(zhì)水解物的分離。
但是大孔硅膠也能較好地分離多肽，且具有不同的選擇性和分辨率。

 

 

圖8. 反相高效液相色譜（左側(cè)）常用的小孔（~100埃）粒子只允許少量蛋白質(zhì)進(jìn)入孔內(nèi)，因此限制了表面相互作用。大孔粒子（~300埃，右側(cè)）允許蛋白質(zhì)進(jìn)入孔內(nèi)與疏水界面相互作用。

疏水界面。用碳?xì)浠�合物分子�?duì)硅膠進(jìn)行改性，從而形成疏水界面。
含烴鏈的氯硅烷，如十八烷基氯硅烷，與硅膠（表面有極性硅烷醇基）反應(yīng)使碳?xì)浠�合物附著在硅膠表面（圖9）。
由于位阻效應(yīng)，有機(jī)硅烷分子僅與硅膠表面部分硅烷醇基反應(yīng)，因此大量的極性硅烷醇基仍然會(huì)留在硅膠表面。
在“封端”過(guò)程中，較小的有機(jī)硅烷依次與極性硅烷醇基反應(yīng)，從而減少硅膠表面極性硅烷醇基的數(shù)量。
 

選擇分離表面。硅膠表面改性所用的化學(xué)過(guò)程允許多種有機(jī)基團(tuán)附著在硅膠表面。
最常見的改性是鍵合一條十八碳線性脂肪鏈，形成“C18”柱或ODS柱（圖10A）。
如圖所示，有機(jī)氯硅烷與大多數(shù)硅烷醇基反應(yīng)，但仍有部分不反應(yīng)，這會(huì)在硅膠表面形成一層較厚的碳?xì)浠�合物層�?br /> 蛋白質(zhì)和多肽可以吸附到該碳?xì)浠�合物層�?br /> C18柱尤用于分子量小于2~3000道爾頓多肽的分離，并且通常是分離由蛋白酶水解蛋白（見26~31頁(yè)）產(chǎn)生的多肽以及分離天然和合成肽的選擇柱。
由丁基鍵合至硅膠表面形成的疏水相較少（圖10B）。
丁基相最適合蛋白質(zhì)分離，但也可用于分離大分子肽或疏水性肽。
 

圖9. 通過(guò)利用有機(jī)氯硅烷將疏水性配體化學(xué)鍵合到硅膠表面形成了疏水界面。

蛋白質(zhì)可用C18柱分離，但一些蛋白質(zhì)利用C18柱分離峰形較差或出現(xiàn)拖尾峰，因此蛋白質(zhì)分離推薦用C4柱。
其它用于多肽分離的柱包括苯基柱（參考文獻(xiàn)6），其在疏水性方面與C4柱類似，是一種極性嵌入或極性封端柱，能夠增強(qiáng)多肽與硅膠粒子表面的相互作用。
因此，對(duì)多肽具有不同的選擇性。

多肽選擇性。柱對(duì)多肽的選擇性受鍵合相性質(zhì)和特征以及底層硅膠表面的影響。不同的反相柱具有不同的多肽選擇性。尤其是：

• 硅膠表面的相數(shù)（碳負(fù)載）影響選擇性。當(dāng)鍵合到硅膠表面的碳?xì)浠�合物較少時(shí)（較低的碳負(fù)載），相比于碳負(fù)載更高的柱，極性硅烷醇基對(duì)分離的影響更大，因此會(huì)導(dǎo)致選擇性不同。

• 不同的制造工藝會(huì)產(chǎn)生性質(zhì)不同的硅膠，從而影響多肽的選擇性。

圖10.

 

A    C18疏水柱用于分子量小于2000-3000道爾頓多肽的分離效果極佳
B      C4疏水柱用于分子量大于3000道爾頓的多肽以及蛋白質(zhì)的分離效果極佳。

 

 

柱長(zhǎng)度。小分子與硅膠粒子表面相互作用越多,分辨率就越高；采用長(zhǎng)柱比短柱的分辨率高。

但吸附在柱頂附近的蛋白質(zhì)隨后會(huì)被洗脫下來(lái),被洗脫后與硅膠粒子表面的相互作用就不再明顯（圖11）。

 

盡管數(shù)據(jù)顯示蛋白質(zhì)與硅膠粒子表面仍存在部分相互作用，但這種相互作用不具選擇性，不能提高蛋白質(zhì)間的分辨率。

 

 

柱的長(zhǎng)度對(duì)蛋白質(zhì)的分離沒(méi)有影響，短柱和長(zhǎng)柱的分離效果相同。

 

由于與蛋白質(zhì)相比，多肽與疏水性反相粒子表面的相互作用較弱，因此柱的長(zhǎng)度在多肽和蛋白質(zhì)水解物的分離中的影響更大。

如圖12所示，采用長(zhǎng)柱分離多肽的分辨率通常比短柱要高。

多肽分離建議采用長(zhǎng)度為15或25厘米的色譜柱。

 

圖11. 蛋白質(zhì)在柱頂附近吸附和解吸。解吸后，蛋白質(zhì)幾乎不與疏水相發(fā)生相互作用，因此增加柱的長(zhǎng)度不會(huì)提高與蛋白質(zhì)的分辨率，而會(huì)提高與小分子的分辨率。

 

圖12. 與蛋白質(zhì)相反，多肽通常在長(zhǎng)柱上分辨率更高。

色譜柱：C18小孔，4.6 x 150或250 mm
洗脫液：梯度：0 - 70% 乙腈，60分鐘洗脫

 

 

柱內(nèi)徑。分析型HPLC柱的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)徑為4.6 mm。此類柱的最佳流速為~1 ml/min。

市場(chǎng)上可買到孔徑更小的柱，多用于滿足特定要求和目的。

細(xì)孔柱（~2 mm內(nèi)徑）的流速為~ 200微升/分鐘，因此與4.6mm內(nèi)徑的分析柱相比，所用溶劑更少。

同時(shí)，細(xì)孔柱的靈敏度約為標(biāo)準(zhǔn)分析柱的五倍。

這是因?yàn)槊糠昼娏鬟^(guò)檢測(cè)器的溶劑量更少，導(dǎo)致蛋白質(zhì)或多肽的峰值濃度更高。

紫外檢測(cè)器和電噴射質(zhì)譜儀等濃度型檢測(cè)器對(duì)小孔柱的靈敏度更高。

 

微徑柱的流速為~50微升/分鐘，因此采用微徑柱的靈敏度更高，約為分析柱的50倍。

毛細(xì)管柱的流速為1~50微升/分鐘，具有更高的相對(duì)靈敏度，約為分析柱靈敏度的200倍。

但由于所采用的流速和更大的死體積，微徑柱和毛細(xì)管柱需要特殊儀器。

在使用微徑柱的過(guò)程中必須格外小心。

圖13和附錄中總結(jié)了柱的特性。

 

圖13. 不同內(nèi)徑色譜柱的特性