布魯氏菌的檢測方法！
布魯氏菌的檢測方法！
熒光偏振方法(Fluorescence polarisation assay， FPA)是以熒光素標記物作為示蹤劑來檢測抗原/抗體相互作用的一種簡便技術(shù)，該方法屬于同源性分析，分析物不需進行分離，因而該法簡便快捷。FPA 診斷布魯氏菌的特異性和敏感性幾乎和競爭 ELISA (Competitive enzyme-linked immunosorbent assay，C-ELISA)相同，一次檢測僅需15 min，即可完成上百份樣品的檢測，可應(yīng)用于動物群體布魯氏菌病的檢疫、篩查和凈化。FPA 檢測方法在某些發(fā)達國家已經(jīng)得到了大量應(yīng)用，并經(jīng)研制開發(fā)了商品化 FPA 檢測試劑盒。
而我國對 FPA 檢測方法的研究起步較晚，目前尚無商品化 FPA 檢測試劑盒，進出口貿(mào)易中牛、羊布魯氏菌病 FPA 檢測方法均依賴于使用進口試劑盒，因此開發(fā)布魯氏菌熒光偏振抗體檢測方法有其現(xiàn)實意義。本研究使用異硫氰酸熒光素 (Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標記的布魯氏菌光滑型 LPS 的小分子片段脂多糖-O-鏈(O-polysaccharide，OPS) 作為抗原，通過對標記抗原、反應(yīng)條件、結(jié)果判斷標準等多方面條件的優(yōu)化，建立敏感性和特異性良好的布魯氏菌熒光偏振方法，為多種動物布病檢測提供快速高通量的新技術(shù)手段。
材料與方法
一、材料
⒈菌種：豬布魯氏菌 S2 菌株(CVCC 70502)由本實驗室保存。
⒉實驗用血清：布魯氏菌病陽性血清國家標準品由本實驗保存，布魯氏菌病陰、陽性血清樣本由本實驗采集并保存。
⒊主要試劑和儀器： 布魯氏菌熒光偏振試劑盒購自 Diachemix 公司；胰大豆肉湯(TSB)和胰大豆瓊脂(TSA)購自美國BD公司；異硫氰酸熒光素(FITC)、表面活性劑脫氧膽酸鈉(Sodium deoxycholate)、三乙胺購自 Sigma 公司；SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒購自康為世紀公司。低溫離心機購自 Sigma 公司；超聲破碎儀購自新芝生物科技有限公司；Powerpac Universal 通用型電源購自美國 Bio-Rad 公司。
二、方法
⒈O(jiān)PS 的提取及標記：(1) OPS 提取。鑒定合格的 B. suis 2 株二級種子，大量培養(yǎng)并滅活，參照世界動物衛(wèi)生組織(OIE)編著的《陸生動物診斷試驗和疫苗手冊》提取 OPS。上清液置 100 倍蒸餾水透析過夜，用 PEG 8000 濃縮 40 倍，再次置于蒸餾水透析過夜，收集透析袋內(nèi)容物，分裝成 2 mL/瓶凍干保存，此即提純的 OPS。 (2) OPS 鑒定與標記。參照徐先棟等[13]改良的脂多糖快速銀染方法對其進行銀染。銀染鑒定的 OPS進行標記，步驟如下：將4 mg OPS加入到2 mL 0.5% (體積比)的三乙胺溶液中，置 4 °C 超聲處理 15 min，超聲后加入 200 μL 100 mmol/L 的 EDTA 溶液，并用 10 μL 1 mol/L 的鹽酸將溶液 pH 調(diào)為 5.0。取 20 mg FITC (異構(gòu)體 I)溶解于 800 μL 0.25 mol/L 的硼酸溶液(pH 10.5)中，然后全部加入到 OPS 溶液中，繼續(xù)超聲處理 1 min。加入 1 mL 1.6%脫氧膽酸鈉溶液，37 °C 攪拌孵育 18 h。4 °C、10 000×g 離心 30 min，濃縮，透析，將透析物用 PD-10 柱脫鹽，收集所有 FITC-OPS 標記物，合并后再濃縮，透析，收集透析后產(chǎn)物 4 °C 保存，即為標記抗原原液。
⒉FPA 試劑盒條件優(yōu)化：
(1) FPA 步驟。取反應(yīng)板，將待檢血清、陽性對照血清和陰性對照血清分別加入到 ELISA 板中，20 μL/孔，其中陽性對照血清加 1 孔(孔 1)和陰性對照血清各加 3 孔 (孔 2、3、4)。加樣過程要注意避免產(chǎn)生氣泡。每孔加 180 μL 樣品稀釋液，充分混勻。室溫下孵育反應(yīng)板 3−5 min。讀取每孔的空白值。每孔立即加入 10 μL 熒光標記抗原，充分混勻。室溫下孵育反應(yīng)板 3−5 min。讀取每孔偏振值。
(2) 布魯氏菌熒光偏振(FPA)檢測試劑盒陰、 陽性對照血清的制備。采用虎紅平板凝集試驗、試管凝集試驗及補體結(jié)合試驗檢測臨床牛。3 種方法均檢測為陰性的牛作為制備陰性血清的候選牛。對 3 種方法均檢測為陽性的牛進行強毒株 M28 免疫，當(dāng)效價超過 800 IU/mL 時制備陽性血清。
(3) 布魯氏菌熒光偏振試劑盒(FPA)標記抗原濃度及稀釋液的選擇。棋盤法分別采用陰性和陽性血清各兩份，通過稀釋抗原濃度與選用不同的樣品稀釋液確定該方法的抗原稀釋濃度和最佳樣品稀釋液。
⒊臨界值的確定：取經(jīng)虎紅平板凝集試驗、試管凝集試驗、補體結(jié)合試驗檢測均為陽性的血清 148 份、陰性血清 155 份，測定偏振值。采用 SPSS17.0 軟件對檢測結(jié)果進行分析。使用非參數(shù)法構(gòu)建 ROC 曲線，并以 Youden 指數(shù)最大的切點作為陰性和陽性判斷的臨界點，同時確定該試劑盒的敏感性和特異性。
⒋重復(fù)性試驗及保存期試驗：制作 3 批試劑盒 (分別命名為 201506、201507、201508)，使用由本實驗室采集并保存的陽性血清測定試劑盒批內(nèi)和批間的重復(fù)性。
⒌臨床樣本檢驗：將臨床采集的 400 份樣品分別使用本實驗建立的 FPA 方法和進口 FPA 試劑盒進行檢測，比較其差異性。
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熒光偏振方法(Fluorescence polarisation assay， FPA)是以熒光素標記物作為示蹤劑來檢測抗原/抗體相互作用的一種簡便技術(shù)，該方法屬于同源性分析，分析物不需進行分離，因而該法簡便快捷。FPA 診斷布魯氏菌的特異性和敏感性幾乎和競爭 ELISA (Competitive enzyme-linked immunosorbent assay，C-ELISA)相同，一次檢測僅需15 min，即可完成上百份樣品的檢測，可應(yīng)用于動物群體布魯氏菌病的檢疫、篩查和凈化。FPA 檢測方法在某些發(fā)達國家已經(jīng)得到了大量應(yīng)用，并經(jīng)研制開發(fā)了商品化 FPA 檢測試劑盒。
而我國對 FPA 檢測方法的研究起步較晚，目前尚無商品化 FPA 檢測試劑盒，進出口貿(mào)易中牛、羊布魯氏菌病 FPA 檢測方法均依賴于使用進口試劑盒，因此開發(fā)布魯氏菌熒光偏振抗體檢測方法有其現(xiàn)實意義。本研究使用異硫氰酸熒光素 (Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標記的布魯氏菌光滑型 LPS 的小分子片段脂多糖-O-鏈(O-polysaccharide，OPS) 作為抗原，通過對標記抗原、反應(yīng)條件、結(jié)果判斷標準等多方面條件的優(yōu)化，建立敏感性和特異性良好的布魯氏菌熒光偏振方法，為多種動物布病檢測提供快速高通量的新技術(shù)手段。
材料與方法
一、材料
⒈菌種：豬布魯氏菌 S2 菌株(CVCC 70502)由本實驗室保存。
⒉實驗用血清：布魯氏菌病陽性血清國家標準品由本實驗保存，布魯氏菌病陰、陽性血清樣本由本實驗采集并保存。
⒊主要試劑和儀器： 布魯氏菌熒光偏振試劑盒購自 Diachemix 公司；胰大豆肉湯(TSB)和胰大豆瓊脂(TSA)購自美國BD公司；異硫氰酸熒光素(FITC)、表面活性劑脫氧膽酸鈉(Sodium deoxycholate)、三乙胺購自 Sigma 公司；SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒購自康為世紀公司。低溫離心機購自 Sigma 公司；超聲破碎儀購自新芝生物科技有限公司；Powerpac Universal 通用型電源購自美國 Bio-Rad 公司。
二、方法
⒈O(jiān)PS 的提取及標記：(1) OPS 提取。鑒定合格的 B. suis 2 株二級種子，大量培養(yǎng)并滅活，參照世界動物衛(wèi)生組織(OIE)編著的《陸生動物診斷試驗和疫苗手冊》提取 OPS。上清液置 100 倍蒸餾水透析過夜，用 PEG 8000 濃縮 40 倍，再次置于蒸餾水透析過夜，收集透析袋內(nèi)容物，分裝成 2 mL/瓶凍干保存，此即提純的 OPS。 (2) OPS 鑒定與標記。參照徐先棟等[13]改良的脂多糖快速銀染方法對其進行銀染。銀染鑒定的 OPS進行標記，步驟如下：將4 mg OPS加入到2 mL 0.5% (體積比)的三乙胺溶液中，置 4 °C 超聲處理 15 min，超聲后加入 200 μL 100 mmol/L 的 EDTA 溶液，并用 10 μL 1 mol/L 的鹽酸將溶液 pH 調(diào)為 5.0。取 20 mg FITC (異構(gòu)體 I)溶解于 800 μL 0.25 mol/L 的硼酸溶液(pH 10.5)中，然后全部加入到 OPS 溶液中，繼續(xù)超聲處理 1 min。加入 1 mL 1.6%脫氧膽酸鈉溶液，37 °C 攪拌孵育 18 h。4 °C、10 000×g 離心 30 min，濃縮，透析，將透析物用 PD-10 柱脫鹽，收集所有 FITC-OPS 標記物，合并后再濃縮，透析，收集透析后產(chǎn)物 4 °C 保存，即為標記抗原原液。
⒉FPA 試劑盒條件優(yōu)化：
(1) FPA 步驟。取反應(yīng)板，將待檢血清、陽性對照血清和陰性對照血清分別加入到 ELISA 板中，20 μL/孔，其中陽性對照血清加 1 孔(孔 1)和陰性對照血清各加 3 孔 (孔 2、3、4)。加樣過程要注意避免產(chǎn)生氣泡。每孔加 180 μL 樣品稀釋液，充分混勻。室溫下孵育反應(yīng)板 3−5 min。讀取每孔的空白值。每孔立即加入 10 μL 熒光標記抗原，充分混勻。室溫下孵育反應(yīng)板 3−5 min。讀取每孔偏振值。
(2) 布魯氏菌熒光偏振(FPA)檢測試劑盒陰、 陽性對照血清的制備。采用虎紅平板凝集試驗、試管凝集試驗及補體結(jié)合試驗檢測臨床牛。3 種方法均檢測為陰性的牛作為制備陰性血清的候選牛。對 3 種方法均檢測為陽性的牛進行強毒株 M28 免疫，當(dāng)效價超過 800 IU/mL 時制備陽性血清。
(3) 布魯氏菌熒光偏振試劑盒(FPA)標記抗原濃度及稀釋液的選擇。棋盤法分別采用陰性和陽性血清各兩份，通過稀釋抗原濃度與選用不同的樣品稀釋液確定該方法的抗原稀釋濃度和最佳樣品稀釋液。
⒊臨界值的確定：取經(jīng)虎紅平板凝集試驗、試管凝集試驗、補體結(jié)合試驗檢測均為陽性的血清 148 份、陰性血清 155 份，測定偏振值。采用 SPSS17.0 軟件對檢測結(jié)果進行分析。使用非參數(shù)法構(gòu)建 ROC 曲線，并以 Youden 指數(shù)最大的切點作為陰性和陽性判斷的臨界點，同時確定該試劑盒的敏感性和特異性。
⒋重復(fù)性試驗及保存期試驗：制作 3 批試劑盒 (分別命名為 201506、201507、201508)，使用由本實驗室采集并保存的陽性血清測定試劑盒批內(nèi)和批間的重復(fù)性。
⒌臨床樣本檢驗：將臨床采集的 400 份樣品分別使用本實驗建立的 FPA 方法和進口 FPA 試劑盒進行檢測，比較其差異性。
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