ACE HILIC法開發(fā)平臺和工作實例圖17顯示了HILIC方法開發(fā)的流程圖。
一般方法是：收集分析物相關(guān)的信息（如果已知的話），針對三個ACE HILIC相（用三款不同的ACE HILIC色譜柱在不同的pH洗脫液條件下）執(zhí)行梯度或等度HILIC篩選實驗（取決于樣本分析物的親水性范圍），然后再優(yōu)化色譜法以達到可接受的HILIC法。
表1中列出了ACE HILIC篩選條件。
這些設(shè)計旨在探索廣泛的選擇性范圍，以及為達到所需分離提供一個良好的起點。
圖17
ACE HILIC 方法開發(fā)流程圖

表1
ACE HILIC篩選實驗的條件

 

參數(shù)                            備注
色譜柱	ACE HILIC-A, ACE HILIC-B and ACE HILIC-N, 150 x 4.6 mm, 5 µm
梯度流動相	A：10 mM甲酸銨（溶于MeCN/H2O中）（94:6 v/v） B：10 mM甲酸銨（溶于MeCN/H2O中）（50:50 v/v）甲酸銨的pH值為：3.0、4.7或6.0.
梯度篩選	時間                                               %B
	0	0
	15	100
	20	100
	21	0
	41	0
等度流動相	10 mM甲酸銨（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）甲酸銨的pH值為：3.0、4.7或6.0.
流速	1.5 mL/min
溫度	25 °C
檢測	取決于樣本（視樣品而定）

ACE HILIC色譜柱保存方法
使用之后，ACE HILIC色譜柱應(yīng)使用體積比為7:3的乙腈和水進行沖洗，清除掉所有的緩沖鹽。
然后，使用100%的異丙醇、以更低的流速進行沖洗，以便貯存。應(yīng)往回擰緊色譜柱端蓋（擰緊色譜柱端蓋），并將色譜柱放回盒內(nèi)。
每次分析運行之后，除非第二天要使用，否則建議采用密閉法（按長期保存的方法）清洗色譜柱，然后用異丙醇沖洗。


實例1 – 咖啡因和相關(guān)化合物
方法開發(fā)中所需的咖啡因和四種相關(guān)化合物（可可堿、茶堿、次黃嘌呤和黃嘌呤）這些化合物都是極性的中性物質(zhì)，其中負log P值表示合理的親水性（log P為負值明確的表明其親水性），因此適用于HILIC（圖18）。
圖18
咖啡因和相關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和log P數(shù)據(jù)



咖啡因和相關(guān)化合物在pH為3-6的情況下不可電離，因此洗脫劑的pH幾乎不會直接影響分子。
為此，選擇pH 3.0和4.7。
固定相會受洗脫劑pH變化的影響，這可能是有利的一面。
固定相的電離變化將影響粒子周圍的水合層，這會影響分析物分散到相中（分配在固定相上）或形成氫鍵的程度。
因此，在pH3.0和pH4.7的情況下對三個固定相進行篩選，結(jié)果如圖19中所示。
新的ACE HILIC色譜柱使用60倍柱體積相互平衡（平衡），以在粒子周圍形成水合層。表1中顯示了流動相、梯度和溫度。
篩選結(jié)果顯示：三個固定相與兩個pH值之間觀察到一些選擇性差異（三個固定相在兩個pH值下的篩選結(jié)果可以看出彼此間具有選擇性的差異）。
基于篩選數(shù)據(jù)的最有效分離是針對pH為3.0下的（pH為3.0下的）ACE HILIC-N相。
這些數(shù)據(jù)選擇（選定這些條件）用于進一步優(yōu)化。


圖19
ACE HILIC色譜柱的梯度篩選


條件如表1中所述，275nm條件下的檢測除外。進樣25mg/mL的咖啡因混合物2μL（使用pH3.0和pH4.7的甲酸銨，以0.5%w/w的比例混合相關(guān)物質(zhì)和MeCN/H2O（90:10 v/v））
樣本：
1) 咖啡因
2) 茶堿
3) 可可堿
4) 黃嘌呤
5) 次黃嘌呤


較早洗脫峰的保留窗口（時間段）非常窄，這表示：等度HILIC可用于分離分析物。（等度方式的HILIC可以被用于分離這些化合物）10mM甲酸銨，pH3.0（溶于MeCN/H2O中）（94:6 v/v）被選為等度條件（圖20）。
在這些條件下，峰4和5要保留得更多（好），但峰2和3仍未解析出（被分離）。
根據(jù)梯度運行的結(jié)果，乙腈含量更高似乎不會提高峰2和3的解析度（高的乙腈含量沒有提高2與3峰的分離度），所以梯度HILIC分析得到改善（所以梯度分析是對混合物分離有更合適的，溫度將被研究），從而開發(fā)出最終方法，如圖21所示。


圖20
ACE HILIC-N相中咖啡因和相關(guān)化合物的等度分析

ACE HILIC-N相中咖啡因和相關(guān)化合物的等度分析
色譜柱：ACE 5 HILIC-N，
150 x 4.6 mm
流動相：10 mM甲酸銨，pH3.0（溶于MeCN/H2O中）（94:6 v/v）
流速：1.5 mL/min
溫度：25 °C
檢測：UV, 275 nm
進樣：2 μL
樣本：
1) 咖啡因
2) 茶堿
3) 可可堿
4) 黃嘌呤
5) 次黃嘌呤


溫度的降低會提高茶堿與可可堿之間的解析度（分離度），因此，最終方法（圖21）被認為適合其用途。


圖21
最終開發(fā)方法：

色譜柱：ACE 5 HILIC-N，150 x 4.6 mm
流動相：A = 10mM甲酸銨（pH3.0）溶于MeCN/H2O中（96:4 v/v）中 B = 10mM甲酸銨（pH3.0）溶于MeCN/H2O（1:1 v/v）中
梯度：0-100%B在15分鐘內(nèi)，100%B持續(xù)5分鐘，下一次進樣維持在起始條件20分鐘
流速：1.5 mL/min
溫度：15 °C
檢測：275 nm
進樣：2 μL


實例2 – 肌酸和肌酐
肌酸（圖22）是使用甘氨酸和精氨酸合成的氨基酸。
它在為體內(nèi)細胞提供能量方面起著重要作用（在體內(nèi)主要用于為細胞供能），并形成（生成）副產(chǎn)品肌酐。測定血液中的肌酐，確定腎功能是否正常，其中肌酐水平的增加表示腎可能不會完全過濾廢物。（升高表明腎的過濾廢物的功能有所降低）
圖22
結(jié)構(gòu)和log P肌酸和肌酐數(shù)據(jù)

圖23
使用pH為3.0、4.7和6.0的甲酸銨對ACE HILIC范圍的等度篩選對比
樣本：
1) 肌酐
2) 肌酸
在三種pH值條件下，利用等度條件對三個HILIC固定相的兩種分析物進行篩選。
結(jié)果表明：肌酐在三個ACE HILIC相中被適當?shù)乇Ａ�，但由于過度保留的原因，肌酸在合理的時間內(nèi)沒有洗脫。
根據(jù)圖17中的流程圖，過度保留窗口表示梯度（寬時間段表明梯度方法）可能更適宜。



圖24
ACE HILIC-A相下的最終方法
ACE HILIC-A在pH3.0下選擇，進行梯度分析。
標準梯度在10分鐘內(nèi)析出兩種目標分析物，并且解析度很高（分離度很高）（數(shù)據(jù)未顯示）。因此，這使得梯度時間進一步減少（這種情況下可以使梯度運行時間進一步減少），從而縮短了整體運行時間。
最終方法如圖24中所示。

色譜柱：150 x 4.6 mm, 5 μm
流動相：
A：2 mM甲酸銨（pH3.0）溶于MeCN/H2O（90:10 v/v）中
B: 2 mM甲酸銨（pH3.0）溶于MeCN/H2O（50:50 v/v）中
梯度：5-55%B，在10分鐘內(nèi)
流速：1.5 mL/min
檢測：230 nm
進樣：5 μL
樣本：
1) 肌酐
2) 肌酸


結(jié)論
HILIC是一種用于多用途的極性分析物色譜分析法（對于極性化合物來說是一種通用的色譜分析模式）。
這種方法比較復(fù)雜，但如果遵循簡單規(guī)則，則可實現(xiàn)可再現(xiàn)的HILIC方法（HILIC方法是可以重現(xiàn)性的）。
三個ACE HILIC相（固定相）設(shè)計用于HILIC方法開發(fā)期間研究選擇性，并盡可能快地提供實現(xiàn)所需分離的選項。
ACE HILIC方法驗證協(xié)議（規(guī)程）已成功用于開發(fā)一系列的HILIC方法，應(yīng)為HILIC方法開發(fā)活動提供一種結(jié)構(gòu)化的方法。