HILIC是一種復(fù)雜的分離技術(shù),通過多種相互作用模式來實(shí)現(xiàn)保留。
這些相互作用的權(quán)重(中哪種是主要作用)是基于固定相、流動(dòng)相和分析物的理化特性。
為了得到可靠和穩(wěn)健的HILIC方法,了解潛在的不同相互作用(了解可能存在的不同相互作用)是很有幫助的。
這樣可以為待進(jìn)行的方法開發(fā)合理選擇色譜柱和條件。(這樣可以為方法開發(fā)的色譜柱和條件做出合理的選擇)
HILIC中的流動(dòng)相通常包含大量的乙腈(>70%)以及至少3%的水。
水性組分使得極性固定相周圍存在親水環(huán)境,并且形成吸附水層以便分析物分散(分配)。
主要的HILIC保留機(jī)制包括:
分析物分散(分配)到吸附水層,各種極性相互作用和靜電(即離子交換式)相互作用(參見圖3)。
如果將極性分析物通入(極性分析物進(jìn)入)HILIC環(huán)境中,則可使用這些保留機(jī)制中的任意一種(則物質(zhì)的保留可能是任何一種機(jī)制作用,也可能是所有機(jī)制同時(shí)作用)。
圖3
潛在HILIC保留機(jī)制圖示
極性分析物通常包含能夠與其它極性基團(tuán)相互作用的各種基團(tuán),如:固定相上的基團(tuán)。極性相互作用包括氫鍵和偶極-偶極與其它基團(tuán)的相互作用。帶
電分析物也可以進(jìn)行靜電或離子交換式相互作用,其中分析物可以被固定相吸引或排斥。
例如,一個(gè)帶負(fù)電的或酸性的分析物會(huì)被帶負(fù)電的(即酸性的)固定相排斥。
但是,帶正電的或堿性的分析物可被帶負(fù)電的(酸性的)固定相保留,反之亦然。
ACE HILIC色譜柱固定相:
過去,許多HILIC固定相都采用非鍵合硅膠。
這些酸性相提供了必要的相(固定相必要的)極性,以在(使其能)HILIC模式中與高有機(jī)物含量洗脫劑很好地相互作用。
非鍵合硅膠相很有(好)用,所以仍在廣泛使用。
最近,在市場(chǎng)上已經(jīng)可以買到專門用于HILIC環(huán)境的各種鍵合相(固定相)。
這些新的極性鍵合相根據(jù)相(固定相的)特性可分為很多種,包括酸性的、堿性的、中性的和新型的化學(xué)相。
ACE HILIC組合目前包括酸性的、中性的和堿性的固定相。
這些相已被證實(shí)可相互提供不同的選擇性。
這些(三款)ACE相(固定相)彼此提供了替代選擇性,可參見圖4.九種組分混合物中的中性和帶電分析物,在相同條件下,對(duì)三種不同的ACE HILIC相(在三款不同固定相的ACE HILIC色譜柱上)顯現(xiàn)出不同的保留和洗脫順序。
這清楚地表明:HILIC模式下各ACE HILIC固定相之間存在選擇性差異,使得這三種色譜柱成為HILIC方法開發(fā)的理想選擇。
圖4
ACE HILIC固定相范圍內(nèi)洗脫順序的對(duì)比
色譜柱:150 x 4.6 mm, 5 μm
流動(dòng)相:10 mM甲酸銨,pH4.7(溶于MeCN/H2O中)(90:10 v/v)
流速:1.5 mL/min
溫度:25 °C
檢測(cè):UV, 254 nm
樣品:
1) 對(duì)氨基苯甲酸
2) 4-羥基苯甲酸
3) 煙酰胺
4) 醋丁洛爾
5) 腺嘌呤
6) 扁桃酸
7) 酪胺
8) 阿替洛爾
9) 2’-脫氧鳥苷
ACE HILIC-A相
ACE HILIC-A相能形成負(fù)電荷,并顯示出高(強(qiáng))陽離子交換能力。
帶電的堿基(堿性物質(zhì))對(duì)ACE HILIC-A相進(jìn)行(產(chǎn)生)靜電吸引,而帶電的酸性物質(zhì)則被排斥。
ACE HILIC-A相的帶電程度取決于流動(dòng)相的pH值。
ACE HILIC范圍的推薦pH限值為pH2.0到pH7.0。
通過增大pH值,固定相上的負(fù)電荷將變得更明顯,從而保留更多的陽離子分析物。
ACE HILIC-N相
中性ACE HILIC-N相對(duì)陰陽離子都顯示出較低的離子交換能力。
ACE HILIC-N相的保留機(jī)制包括極性相互作用、吸附和一定程度的分散(分配能力)。
ACE HILIC-B相
ACE HILIC-B相具有合理的陰離子交換能力,從而可保留酸性分析物,同時(shí)堿性分析物將被排斥。
與ACE HILIC-A相似,pH值可影響固定相的電荷,因此可減弱或增強(qiáng)該相的正特性(該相的正電荷特性)。