Proteomics Reveals Global Regulation of Protein SUMOylation by ATMand ATR Kinases during Replication Stress文獻， 目的是通過質譜技術分析sumo化修飾和磷酸化修飾在細胞面對DNA復制壓力時的信號傳遞、相互影響和關聯(lián)的機制。

IF 8.282

課題背景

真核生物DNA復制是耗時且非常具有挑戰(zhàn)性的過程，DNA復制的正常進行是維持正常細胞活動的基礎，所以需要精準的保護機制來應對內(nèi)外環(huán)境的波動，一旦保護機制失調導致基因組紊亂，甚至癌癥的發(fā)生。大量報道顯示，精密準確的翻譯后修飾通過DNA損傷應答機制DDR（DNA damage response）為DNA復制保駕護航，其中依賴于磷酸化修飾的信號應答轉過程的重要作用多為熟知。最近也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)SUMO化修飾在該過程中也同樣起到非常重要的作用。然而整體水平兩種修飾在DNA復制損傷時的應答反應是否有相互影響，相互關聯(lián)還鮮為人知。本文章的主題帶著這樣的疑問對兩種大規(guī)模組學相互作用及關聯(lián)展開了深入研究，探討DNA損傷應答中兩種組學的關系。

實驗結論

分別對MMC刺激處理的穩(wěn)轉細胞進行SUMO化修飾和磷酸化修飾進行蛋白或者肽段富集，進行定性定量分析，后通過分析磷酸化修飾蛋白，SUMO修飾蛋白在表達量一致性，修飾蛋白種類重疊性，GO功能相似性放面的對比發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)在DDR發(fā)生過程中一些關鍵蛋白UIMC1，BRCA1等即發(fā)生SUMO化也發(fā)生了磷酸化。并通過大規(guī)模組學實驗labelfree實驗進行進一步對兩種修飾的蛋白分析，發(fā)現(xiàn)在DNA損傷修復時，通過兩種修飾的響應調控，形成相互作用的網(wǎng)絡，共同應對外界損傷。 最后，通過DDR,RS響應的關鍵激酶ATR，ATM給藥前后的的作用底物修飾分析驗證，發(fā)現(xiàn)DNA損傷時ATR激活CHK1，使其發(fā)生磷酸化，且ATR的共同激活因子TOPBP1高度sumo化。進一步揭示了兩種修飾作用的機制。

實驗路線

建立flag-SUMO-2和his10- sumo-2-k0-Q87R穩(wěn)轉的U-2-OS細胞，并進行SILAC（穩(wěn)定同位素標記）技術進行細胞培養(yǎng)。對該細胞使用胸苷阻斷法細胞周期同步化24h后，給予MMC（絲裂霉素)給藥和不給藥刺激，制造細胞DNA損傷狀態(tài)， 分別對陰性對照（未轉染SUMO），SUMO穩(wěn)轉給藥刺激和不給藥刺激三種條件處理的細胞蛋白進行IP富集，通過高分辨質譜儀Q-Exactive high-frequency (HF)進行質譜分析，利用Maxquant軟件對SUMO化蛋白和SUMO位點進行定性定量。其中值得一提的是，在SUMO化檢測實驗中，運用較經(jīng)典的外源引入FLAG-SUMO2-Q87RSUMO蛋白的突變體方法來對SUMO化蛋白進行富集，并通過酶切之后的QQTGG和pyroQQTGG分子量偏移進行SUMO位點鑒定。共鑒定出3453個蛋白，其中702個顯著變化的SUMO化蛋白。通過MMC刺激前后的穩(wěn)轉SUMO-2細胞中，發(fā)現(xiàn)有個187個SUMO蛋白是受MMC刺激變化顯著上升的，SUMO位點共311個。

Sumo化蛋白功能分析

通過對187個MMC處理影響顯著的sumo蛋白進行功能注釋和互作網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn)，這些蛋白主要定位于細胞核中， 且主要與細胞修復相關。

磷酸化修飾分析

在磷酸化大規(guī)模修飾分析實驗中，實驗設計與SUMO化相同，技術路線上采用經(jīng)典的磷酸化富集方法-TIO2，并且采用分級的方式提高磷酸化肽段的鑒定水平。通過該方法共鑒定到磷酸化位點20900個，其中650個磷酸化位點是受MMC處理顯著上調的。通過GO分析也發(fā)現(xiàn)主要定位于細胞何種與DNA損傷修復相關，這與sumo的結果有驚人的相似度。

磷酸化和sumo化聯(lián)合分析

為了說明磷酸化和sumo化之間有比較密切的聯(lián)系，比較了這些受MMC影響的蛋白的定量水平的一致性，發(fā)現(xiàn)兩種組學找到的差異蛋白的定量表達分布形態(tài)高度一致。

通過比較蛋白種類的重疊度，發(fā)現(xiàn)有540個蛋白同時發(fā)生了類泛素化和磷酸化，其中有17個蛋白是在MMC刺激之后兩種修飾均上調的，其中包括已經(jīng)報道的與DDR相關的關鍵蛋白，比如UIMC1，BRCA1等。

為了挖掘兩種該修飾在DDR 和RS（replication stress）中的作用機制，進一步通過WB驗證了在此過程中關鍵的蛋白激酶ATR，ATM的作用底物的磷酸化和SUMO化水平改變。通過DNA損傷刺激及ATR抑制劑處理前后相關激酶底物的SUMO化及磷酸化水平，證實關鍵激酶的激活是通過底物的磷酸化和SUMO等進行信號傳遞并形成相互影響。并且進行了補充label-free分析，對以上結論進行驗證。

小編心得

該篇文獻運用大量的質譜組學技術，對SUMO化，磷酸化在特定條件下進行了深入的定性定量研究，并進行關聯(lián)分析，深入明確的闡述了DNA損傷時的兩種修飾水平的改變及相互影響，是一篇非常典型的質譜應用的技術，其中不僅有修飾富集技術，還利用了普通labelfree技術，SILAC技術等等，這些都是現(xiàn)有質譜領域非常經(jīng)典的方法，為大家做組學甚至是組學聯(lián)合分析提供了一定的思路，非常值得大家借鑒和學習！