編者按

中國農科院質標所陳愛亮教授，研究方向主要為基于現代生物分析技術的食品質量安全快速檢測、鑒別與溯源方法研究及產品研發(fā)等， 利用我司生產的微芯片實時熒光定量PCR儀在食品安全領域進行了大量科學研究，建立了一種基于芯片PCR的快速鑒別羊肉摻假成分的方法，其科研成果發(fā)表在《生物技術進展》2018年的第6期，特此向陳老師表示致敬，以下為陳老師發(fā)表文章《羊肉摻假鑒別快速熒光定量 ＰＣＲ 芯片制備及應用研究 》節(jié)選~~

導語

隨著社會經濟水平的提高，我國居民飲食結構發(fā)生了重大的變化火鍋、羊肉串等備受喜愛。然而，目前羊肉制品摻假現象愈發(fā)嚴重。常見的摻假肉類主要包括豬肉、雞肉、鴨肉等有的甚至還會摻入鼠肉， 這種欺詐行為嚴重損害了消費者權益，同時對社會發(fā)展帶來了消極影響。目前，研究人員已經開發(fā)出多種肉品摻假檢測技術主要包括以蛋白質為基礎的酶聯免疫吸附、色譜質譜技術以代謝物為基礎的紅外光譜技術和以核酸為基礎的ＰＣＲ檢測技術等，其中應用最多的為基于熒光定量ＰＣＲ的檢測技術但是現有技術所需時間較長，無法滿足現場快速鑒別的要求。同時，以羊肉串摻假為例，其摻假的肉類品種可能有豬肉、雞肉、鴨肉、甚至老鼠肉等。如果逐個對可能的摻假物種進行ＰＣＲ檢測則存在操作繁瑣、分析時間長等問題。 

近年來，芯片式快速熒光定量ＰＣＲ技術的發(fā)展為羊肉摻假鑒別等核酸檢測提供了一種快速多重的熒光定量ＰＣＲ檢測方法其是一種將芯片技術與熒光定量ＰＣＲ技術相結合的高新生物技術。傳統的微芯片技術是運用微電機系統技術通過制作微管道等空間結構及微加熱等控制結構，實現芯片上的快速ＰＣＲ擴增而本研究通過將引物、反應所需試劑預先凍干固定到芯片上只需將模板滴加至微孔內即可進行擴增同時利用微芯片實時熒光定量ＰＣＲ儀實現通過熒光信號檢測ＰＣＲ產物該技術也可應用于農業(yè)(植物病 原菌檢測、轉基因鑒別)、畜牧(牛類病害鑒別、魚 類和家禽病原菌檢測)、食品安全(病原菌鑒別、微生物腐敗鑒別)、生命科學和醫(yī)療(人類疾病鑒別、人類基因檢測)等領域。

摘要

為了建立一種基于芯片PCR的快速鑒別羊肉摻假成分的方法，將不同動物源性成分的引物及反應所需試劑預先凍干固定到空白芯片反應池內，以制備羊肉摻假鑒別快速熒光定量ＰＣＲ芯片，同時通過模擬摻假樣品(在羊肉中摻入豬肉、雞肉、鴨肉、鼠肉成分)檢測實驗，對所得芯片的性能進行了評價。從與ＡＢＩ７５００熒光定量ＰＣＲ結果對比可知，基于芯片的快速熒光定量ＰＣＲ檢測方法可以準確檢測５種動物源性成分，具有較高的準確性及可用性，且其ＰＣＲ擴增時間較短，操作簡單，滿足了羊肉摻假快速鑒別的要求，該芯片的研制及快速檢測方法的建立將有效的簡化羊肉制品摻假檢測的步驟、縮短檢測時間，且成本較低，儀器便于攜帶，使現場檢測成為可能，研究結果為我國肉類食品安全監(jiān)管提供了有力保障。

1材料與方法

１.１　 材料與試劑 

羊肉、豬肉、鴨肉、雞肉均購自北京市農貿市 場ꎬ鼠肉由中國農業(yè)科學院飼料研究所提供，二甲基亞砜、牛血清白蛋白、海藻糖等均購自北京雁棲灣生物技術有限公司

１.２　 實驗儀器 

７５００熒光定量 ＰＣＲ 儀(美國 ＡＢＩ 公司)

ＡｒｉａＤＮＡ-１０便攜式微芯片實時熒光定量ＰＣＲ儀 (ＬＵＭＥＸ 分析儀器公司)等

１.３　 樣品制備 

用電子天平稱取羊肉、豬肉、雞肉、鴨肉、鼠肉各２０ｍｇ，用于提取引物特異性實驗所用模板，再按照不同重量百分比(表１)分別稱取不同肌肉組織進行混合作為模擬摻假樣品(每份樣品為２０ｍｇ)，總摻假比例為０~８０％。

１.４　 ＤＮＡ 的提取及檢測 

按照ＴＩＡＮａｍｐＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡＫｉｔ說明書提取制備好的樣品的基因組ＤＮＡ，采用超微量分光 光度計對提取的ＤＮＡ進行濃度及純度檢測ꎮ 其 濃度為１０~２０ｎｇ/μＬ，且純度較高(Ａ２６０/Ａ２８０為 １.８~１.９，Ａ２６０/Ａ２３０>２.０)，因此可用于后續(xù) ＰＣＲ 擴增。

１.５　 引物特異性實驗

研究所用引物均由北京生工生物技術有限公司合成，為了確定引物特異性 在ＡＢＩ７５００儀器上分別用羊源、豬源、雞源、鴨源與鼠源成分的特異性引物對５種肉的基因組 ＤＮＡ進行擴增反應體系(２０μＬ):２×ＰＣＲＭｉｘ １０μＬ１０ｍｏｌ/Ｌ正、反向引物各０.４μＬ，模板 ２ μＬ剩余用無菌去離子水補齊反應程序:９５℃ ５ ｍｉｎ９５℃ ３ ｓ６０℃ ３２ ｓ共 ４０ 個循環(huán)；７２℃ ２ ｍｉｎ 添加熔解曲線。通過擴增Ｃｔ 值(每個反應管內的熒光信號到達設定的閾值時所經歷的循環(huán) 數)來判斷引物的特異性，Ｃｔ<３５為有效擴增Ｃｔ ≥３５為無效擴增。

１.６.１ 芯片的制備　 

本研究的空芯片微陣列設計為５×６陣列，每個位點包含凍干固定的一對引 物(表３)及反應所需試劑。反應體系(２０μＬ):２×ＰＣＲＭｉｘ１０μＬ１０ｍｏｌ/Ｌ正、反向引物各０.４ μＬ，剩余體積用無菌去離子水補齊，同時將５μＬ ０.５ｇ/ｍＬＤＭＳＯ、１.６５~１.９５ｍｇ保護劑ＢＳＡ、０.６~ １.２ｍｇ賦型劑海藻糖與２０μＬ反應體系進行混合，隨后�。�μＬ混合溶液滴加到芯片上，采用 凍干機進行凍干(－４０℃冷凍 ２ ｈ)，置于４℃ 備用。

１.６.２　 芯片式ＰＣＲ反應　 

將２μＬ模擬摻假樣品 １、２、３、４、５的基因組ＤＮＡ分別滴加到芯片的第 １、２、３、４、５列的反應池內，第６列為陰性對照，即不含任何模板。然后用６４０μＬ礦物油將液體覆蓋，以免高溫蒸發(fā)，此方法無需繁瑣的配制體系與 操作步驟，簡單快速ꎮ，反應程序:９５℃５ｍｉｎ，９５℃ ３ｓꎬ６０℃３２ｓ，ꎬ共４０個循環(huán)；７２℃ ２ｍｉｎ： 添加熔 解曲線。

2結果與分析

２.１　 引物特異性實驗 

引物的特異性是動物源性成分核酸檢測技術的關鍵，本研究利用篩選出的羊源、豬源、鴨源、雞 源與鼠源性成分的特異性引物對５種肉的基因組ＤＮＡ進行擴增。用羊源性引物進行擴增時，除了羊源ＤＮＡ出現擴增且所對應的 熔解曲線均為單峰外，其他物種模板均無擴增且 熔解曲線為平滑的一條直線，說明羊源性引物的特異性較好； 豬源、雞源、鴨源與鼠源性引物與羊 的結果一致，表明５對引物特異性好，可用于后續(xù)實驗。

２.２　 自制多重 ＰＣＲ芯片檢測模擬羊肉摻假樣品結果 

本研究利用自制的羊肉摻假鑒別多重 ＰＣＲ 芯片以及ＡｒｉａＤＮＡ-１０便攜式微芯片實時熒光定 量ＰＣＲ儀對５種模擬摻假樣品進行檢測。各靶標的擴增Ｃｔ 值和擴增曲線分表見下表和下圖。 

 

結合芯片式ＰＣＲ和ＡＢＩ７５００熒光定量ＰＣＲ 的結果可知：本研究所建立的擴增體系中在ＡｒｉａＤＮＡ-１０儀器上用芯片進行擴增時和ＡＢＩ７５００熒光定量ＰＣＲ檢測方法的結果高度一致，２種方法均能準確的檢測出５種成分，且隨著動物源性成分含量的減少相應的Ｃｔ值會逐漸增加。要注意的是本研究無法通過Ｃｔ 值進行定量檢測只能進行定性檢測，即確定含有哪種成分的摻假。

根據５種模擬摻假樣品的成分配比可知，每個樣品中均含有羊源性成分。因此，采用羊源性引物對５種模擬摻假樣品進行擴增時，共５條擴增曲線(圖２Ａ)。 同理。豬源、雞源、鴨源與鼠源性引物的位置分別出現４條、３條、２條與１條擴增曲線，結果與已知樣品中所含成分保持一致。由于在實際應用中若摻假比例太低，則獲利微薄。因此，本研究將最低摻假比例設為２０％，未對含量更低的樣品進行檢測，從圖２可以看出利用自制的ＰＣＲ芯片對５種模擬摻假樣品進行檢測均可檢測到相應的動物源性成分，定性檢測準確率 為１００％。同時，擴增曲線表明自制的ＰＣＲ芯片具有較好的擴增效率，而且隨著動物源性成分含量的降低，相應的Ｃｔ 值逐漸增大。

3 討論

本研究建立了基于芯片的快速熒光定量ＰＣＲ檢測方法與傳統的熒光定量ＰＣＲ相比，ＰＣＲ芯片一般由５×４或更多的反應池組成可實現樣品多指標的檢測。由于芯片式ＰＣＲ預先將反應所需試劑和引物凍干保存只需將提取的ＤＮＡ模板滴加到芯片上即可進行擴增簡化了檢測步驟、縮短了檢測時間。通過與ＡＢＩ７５００熒光定量ＰＣＲ結果進行對比，發(fā)現兩者的結果具有一致性，均可準確的檢測出５種成分且Ｃｔ值均隨著動物源性成分比例的減少而升高。目前，已有很多關于利用ＰＣＲ技術檢測肉制品中摻假成分的報道Ｐｒｕｓａｋｏｖａ等采用多重ＰＣＲ擴增法可同時鑒別肉類產品中５種常見的摻假肉類。每種肉類的檢測靈敏度可達３０ｐｇＤａｌｓｅｃｃｏ等采用熒光定量ＰＣＲ的方法可以檢測１０種不同的動物源性成分ꎻ利用該方法對４６種實驗肉品混合物進行了評價，結果顯示所有品種均鑒定正確檢測靈敏度為１％同時對１４種商業(yè)的肉類產品進行分析結果表明１４個樣品中有６個含有雞肉原料，由此可知，該方法對肉類產品的分析是有效和可靠的，普通ＰＣＲ雖然操作簡單、成本較低，但是對產物進行電泳檢測所需時間較長而傳統的熒光定量ＰＣＲ一般需要２ｈ才能完成，不適用于現場檢測。本研究所建立的芯片式熒光定量ＰＣＲ擴增法，由于所需樣本體積小(只需２μＬ)ＰＣＲ升降溫反應速度快，可縮短至３０ｍｉｎ完成擴增及數據收集，操作簡單，實驗周期短。該芯片的研制及快速檢測方法的建立將有效的簡化羊肉制品摻假檢測的步驟、縮短檢測時間，同時所用芯片檢測儀器Ｌｕｍｅｘ體積較小，攜帶方便為現場檢測提供了技術支撐。

 

 

 

 

        來源：LUMEX分析儀器