【經(jīng)典文獻(xiàn)回顧】exFoxp3 Th17細(xì)胞的哲學(xué)獨(dú)白

“我是誰?我從哪里來?我要到哪里去？” 是柏拉圖提出的經(jīng)典哲學(xué)三大問，小編每天早上起床前都要用這個(gè)問題叫醒我沉睡的靈魂。在本期帶來的經(jīng)典文獻(xiàn)回顧中，請跟隨本文作者一起聽一聽ex Foxp3 TH17細(xì)胞的深刻哲學(xué)獨(dú)白吧！

自身免疫性疾病通常由調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）和產(chǎn)生干擾素17的輔助T細(xì)胞（ TH17細(xì)胞）失衡所導(dǎo)致，嚴(yán)重影響著人類的健康。但TH17細(xì)胞的來源仍然有很多未知，于是，主人公ex Foxp3 TH17細(xì)胞的獨(dú)白在自身免疫性關(guān)節(jié)炎中開始了。

第一問 我從哪里來

exFoxp3 TH17細(xì)胞悶悶不樂托腮思考：我作為TH17細(xì)胞的一員，感覺跟其他TH17細(xì)胞小伙伴兒們不是特別合群，常常有不一樣的感覺，我是從哪里來的呢？

讓我從頭開始捋一捋，先找找影響自身免疫性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵人物：表達(dá)Foxp3的Treg細(xì)胞已經(jīng)知道是抑制免疫應(yīng)答的關(guān)鍵角色，小鼠缺失Foxp3會(huì)產(chǎn)生自身免疫疾病，持續(xù)表達(dá)則會(huì)抑制自身免疫，可見Foxp3表達(dá)的穩(wěn)定性是兩者平衡的重要因素。

那么Foxp3的穩(wěn)定性對自身免疫關(guān)節(jié)炎有什么影響呢？ Treg細(xì)胞的發(fā)展和功能受IL-2調(diào)控，F(xiàn)oxp3+T細(xì)胞由Foxp3+-穩(wěn)定CD25（IL-2Rα）hi和Foxp3+-不穩(wěn)定CD25lo細(xì)胞群組成。作者將CD25hiFoxp3+CD4+細(xì)胞和CD25loFoxp3+CD4+細(xì)胞（來源于未處理的DBA/1 Foxp3hCD2小鼠，hCD2作為標(biāo)簽指示Foxp3表達(dá)情況）轉(zhuǎn)移到膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎（collagen-induced  arthritis  ，CIA）疾病模型小鼠上，測定臨床評分及踝關(guān)節(jié)損傷情況，發(fā)現(xiàn)CD25hiFoxp3+CD4+細(xì)胞與對照組及CD25loFoxp3+CD4+細(xì)胞相比減輕了關(guān)節(jié)腫脹和損傷等癥狀（圖1a，b）。將細(xì)胞經(jīng)CFSE染料標(biāo)記后再轉(zhuǎn)移，結(jié)果顯示在脾臟和引流淋巴結(jié)（dLNs）中CD25loFoxp3+CD4+細(xì)胞丟失了部分Foxp3的表達(dá)（30-50%）（圖1c）。由此可見， CD25loFoxp3+CD4+細(xì)胞因?yàn)閬G失了Foxp3而沒有辦法緩解發(fā)炎和骨損傷癥狀。思考到這里，我忍不住想問了：丟掉Foxp3的CD25loFoxp3+CD4+細(xì)胞去哪了？

別著急，我們繼續(xù)追蹤細(xì)胞更長時(shí)間的發(fā)展， 將total Foxp3 + 、CD25hiFoxp3+CD4+和CD25loFoxp3+CD4+細(xì)胞（來源于B6.Ly5.1 Foxp3hCD2小鼠，donor）轉(zhuǎn)到C57BL/6 Ly5.2 關(guān)節(jié)炎小鼠（host）模型中，檢測Foxp3和IL17表達(dá)， CD25loFoxp3+CD4+細(xì)胞失去部分Foxp3表達(dá)，產(chǎn)生了更高的IL-17 （圖1d，e）。且檢測到CD25loFoxp3+ 來源的Ly5.1+Foxp3-CD4+ T細(xì)胞比naïve  CD4+ T細(xì)胞來源的有更多IL-17和CCR6的表達(dá)（兩者為TH17細(xì)胞marker）。這下清楚了，原來這些CD25loFoxp3+CD4+細(xì)胞丟失了Foxp3以后就變成我（exFoxp3 TH17細(xì)胞)了，我是從CD25loFoxp3+CD4+細(xì)胞分化而來呀。

Figure 1. CD25loFoxp3+ T cells are unstable Foxp3⁺ T cells that convert to T_H17 cells under arthritic conditions. 

第二問 我是誰

原來我是從CD25loFoxp3+CD4+細(xì)胞而來，那我到底是誰？我的祖先是誰？

CD25loFoxp3+CD4+細(xì)胞丟失Foxp3成為exFoxp3 T細(xì)胞，那我的祖先是不是exFoxp3 T細(xì)胞呢？那就跟著exFoxp3 T細(xì)胞看一看究竟吧。

百奧賽圖科普系列知識(shí)中有提到熒光報(bào)告基因小鼠有示蹤作用，本節(jié)實(shí)驗(yàn)作者采用熒光標(biāo)記的Foxp3-GFP-Cre小鼠與Rosa-loxp-Stop-loxp-YFP小鼠交配，GFP^-表示Foxp3^-細(xì)胞，GFP⁺表示細(xì)胞正在表達(dá)Foxp3，GFP表達(dá)之后， 同時(shí)cre酶表達(dá)與loxp位點(diǎn)結(jié)合將stop去除，YFP熒光表達(dá)，但如果緊接著Foxp3表達(dá)后丟失，則這部分細(xì)胞的GFP變?yōu)殛幮裕琘FP仍表達(dá)，因此，YFP⁺則表示正在表達(dá)或者曾經(jīng)表達(dá)過Foxp3^[2-3]。根據(jù)熒光表達(dá)情況可以發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)炎小鼠模型中GFP^-YFP⁺細(xì)胞（exFoxp3 T細(xì)胞）占CD4⁺T細(xì)胞的比例，關(guān)節(jié)處比淋巴器官高，且有選擇性的集聚在關(guān)節(jié)滑膜處（圖2a）。與GFP^-YFP^-細(xì)胞（Foxp3-CD4+ T細(xì)胞）相比，exFoxp3細(xì)胞產(chǎn)生更多的RANKL（轉(zhuǎn)錄因子κB受體活化因子配體）和CCR6分子（圖2b） 。IL17陽性的exFoxp3 T細(xì)胞在炎癥關(guān)節(jié)中比例最高（圖2c） 。這均表明exFoxp3 T細(xì)胞獲得了激活TH17表型（ex Foxp3 TH17細(xì)胞，這就是我啦）并聚集在發(fā)炎的滑膜中。

嗯，找到了我的祖先ex Foxp3 T細(xì)胞，那讓我來研究一下我屬于哪個(gè)部落？

exFoxp3 T細(xì)胞可能的來源有三個(gè)：tTreg細(xì)胞（胸腺來源Treg細(xì)胞）、pTreg細(xì)胞（周邊來源的T_reg細(xì)胞）、激活的傳統(tǒng)T細(xì)胞（表達(dá)片刻Foxp3）。Treg細(xì)胞特征性表達(dá)Foxp3并具有特異脫甲基區(qū)域，且表達(dá)一些其他標(biāo)志物分子。將GFP^-YFP^-、 exFoxp3 T細(xì)胞、GFP⁺YFP⁺細(xì)胞的部分分子進(jìn)行流式表達(dá)和甲基化的分析。流式數(shù)據(jù)結(jié)果顯示exFoxp3 T細(xì)胞與GFP⁺YFP⁺細(xì)胞相比，GTIR、Nrp1、KLRG1表達(dá)相近，CD25、FR4、OX40、CD39、CD103表達(dá)較低。說明exFoxp3 T細(xì)胞表達(dá)了更多的Treg 細(xì)胞marker，還是與傳統(tǒng)T細(xì)胞有一定區(qū)別（圖2d）。那屬于哪一類Treg細(xì)胞呢？ tTreg細(xì)胞已知其Foxp3位點(diǎn)是脫甲基的。作者進(jìn)一步通過Foxp3、IL2rα、Ctla4序列CpG甲基化程度進(jìn)行分析， exFoxp3 T細(xì)胞中Foxp3序列大部分被甲基化，Il2ra部分被甲基化（圖2e）。這一結(jié)果與已知的tTreg細(xì)胞特征有所不同。另外，基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)exFoxp3 TH17細(xì)胞高表達(dá)優(yōu)先在pTreg細(xì)胞表達(dá)的分子Cxcr5、Ccr8、Rora、Rorc（更多數(shù)據(jù)請查閱原文補(bǔ)充材料）；文中結(jié)合更多實(shí)驗(yàn)表明ex Foxp3 TH17細(xì)胞很可能來源于pTreg細(xì)胞亞群。

Figure 2. Localization, marker gene expression and DNA methylation status of exFoxp3 T cells in arthritic mice. Results are shown from fate mapping analyses of arthritic Foxp3-GFP-Cre × ROSA26-YFP mice that were performed 2 weeks after secondary immunization. 

第三問 怎么成為我

小編：等等等等，不按邏輯出牌呢，不是應(yīng)該問我要去哪么

我：去去，別打岔，我有更深刻的問題要思考，我是怎么成為現(xiàn)在這個(gè)樣子的？這對理解關(guān)節(jié)炎發(fā)生的機(jī)制很重要

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)ex Foxp3 T_H17細(xì)胞在炎癥關(guān)節(jié)中聚集，作者假設(shè)關(guān)節(jié)中存在細(xì)胞與Foxp3⁺T細(xì)胞反應(yīng)，促使其轉(zhuǎn)變?yōu)門_H17細(xì)胞。設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)從關(guān)節(jié)炎小鼠中分離Thy1⁺CD11b^-細(xì)胞（滑膜成纖維細(xì)胞）和Thy1^-CD11b⁺細(xì)胞（滑膜巨噬細(xì)胞）與Foxp3⁺CD4⁺T細(xì)胞（從未處理的Foxp3^hCD2小鼠中分離）共同培養(yǎng)，Thy1⁺CD11b^-細(xì)胞下調(diào)了Foxp3⁺CD4⁺T細(xì)胞中Foxp3表達(dá)（圖3a）。將Thy1⁺CD11b^-細(xì)胞與Foxp3⁺CD4⁺T細(xì)胞或naïve CD4⁺ T細(xì)胞共同培養(yǎng)，檢測IL17⁺ Foxp3^-細(xì)胞比例變化及細(xì)胞因子的表達(dá)（IFN-γ、IL-4），結(jié)果顯示滑膜成纖維細(xì)胞使exFoxp3 T細(xì)胞上調(diào)了IL-17的表達(dá)水平，IFN-γ和IL-4表達(dá)沒有變化，表明滑膜成纖維細(xì)胞在關(guān)節(jié)中促使Foxp3⁺T細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)門_H17細(xì)胞。Naïve CD4⁺ T細(xì)胞沒有促使發(fā)生這一轉(zhuǎn)變。進(jìn)一步研究這一轉(zhuǎn)變發(fā)生的機(jī)制，將Thy1⁺CD11b^-細(xì)胞和與Foxp3⁺CD4⁺T細(xì)胞共同培養(yǎng)的上清液與細(xì)胞分離分別檢測（圖3d），發(fā)現(xiàn)細(xì)胞并不能引起這個(gè)轉(zhuǎn)變；檢測和分析上清液的細(xì)胞因子表達(dá)，結(jié)果顯示Thy⁺CD11b^-細(xì)胞上清產(chǎn)生較高的IL-6因子，并在IL-17存在的情況下，IL-6表達(dá)進(jìn)一步加強(qiáng)（圖e）。加入抗IL-6抗體抑制了exFoxp3⁺ T_H17細(xì)胞的產(chǎn)生。證明來源于滑膜成纖維細(xì)胞的IL-6是促使Foxp3⁺CD4⁺T細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)門_H17細(xì)胞的關(guān)鍵因素。

Figure 3. Arthritic synovial fibroblasts promote the  conversion of Foxp3⁺ T cells to T_H17 cells in an IL-6– dependent manner. . 

第四問 我有什么高(xie)超(e)的能力

破骨細(xì)胞是造成關(guān)節(jié)炎骨破壞的重要因素。為了評估TH17細(xì)胞在關(guān)節(jié)炎中對骨破壞的影響程度，作者通過破骨細(xì)胞（TRAP染色的多核細(xì)胞，TRAP⁺MNs）計(jì)數(shù)和RANKL、細(xì)胞因子表達(dá)，檢測其誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成的能力。將Foxp3hCD2小鼠與IL-17-GFP小鼠（該小鼠來源于百奧賽圖哦）交配，方便提取IL-17表達(dá)細(xì)胞。exFoxp3 TH17細(xì)胞、Foxp3+T細(xì)胞、IL17a^-/-TH17細(xì)胞分別與滑膜成纖維細(xì)胞、骨髓源肥大和巨噬前體細(xì)胞（BMMs）共同培養(yǎng)，結(jié)果顯示，exFoxp3 TH17細(xì)胞比TH17細(xì)胞（naïve CD4⁺T細(xì)胞來源的）具有更強(qiáng)的破骨細(xì)胞生成能力（圖4a,b）。 TH17細(xì)胞的誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成能力主要來自IL-17的表達(dá)，IL-17可以刺激成纖維細(xì)胞上RANKL表達(dá)， TH17細(xì)胞雖然本身也產(chǎn)生RANKL，但細(xì)胞自身單獨(dú)沒有辦法誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成。而IL17a^-/- exFoxp3 TH17細(xì)胞缺失IL-17A表達(dá)仍可以誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成，說明是T細(xì)胞來源的RANKL或細(xì)胞因子而不是IL-17A對破骨細(xì)胞生成有潛在影響（圖4b）。作者發(fā)現(xiàn)exFoxp3 TH17細(xì)胞比naïve CD4⁺T細(xì)胞來源的TH17細(xì)胞 表達(dá)了更高水平的RANKL，經(jīng)過滑膜成纖維細(xì)胞共同培養(yǎng)，RANKL表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)。（圖4c）

如圖4d，exFoxp3 TH17細(xì)胞與BMMs共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在沒有滑膜成纖維細(xì)胞存在的時(shí)候，exFoxp3 TH17細(xì)胞也有將BMMs誘導(dǎo)生成破骨細(xì)胞的能力。為了探究RANKL對exFoxp3 TH17細(xì)胞和滑膜成纖維細(xì)胞的影響，文中在共同培養(yǎng)系統(tǒng)中使用exFoxp3 TH17細(xì)胞（從Lck-cre（T淋巴細(xì)胞特異cre小鼠） Tnfsf11（編碼RANKL）flox/△ Foxp3hCD2 小鼠中分離）或Tnfsf11缺失的滑膜成纖維細(xì)胞。結(jié)果表示RANKL的表達(dá)是滑膜成纖維細(xì)胞促使破骨細(xì)胞生成的關(guān)鍵因素，而在沒有表達(dá)RANKL的滑膜成纖維細(xì)胞存在下，exFoxp3 TH17細(xì)胞中RANKL的表達(dá)也能夠促使破骨細(xì)胞生成（圖4e，f）。

用GeneChip分析exFoxp3 TH17細(xì)胞和TH17細(xì)胞（naïve CD4⁺T細(xì)胞來源的），相比之下，exFoxp3 TH17細(xì)胞表達(dá)了更高的Ccr6、Ccl20、Il23r，Il17re，Tnfrsf21，Vcam1，Rorc和Tnfsf11，較低的Csf2，Tnf，Il10和Sgk1。結(jié)果說明exFoxp3 TH17細(xì)胞與多數(shù)已知的致病性的TH17細(xì)胞亞群并不相同，組成一種新的致病性TH17細(xì)胞亞群。

看看，同樣都是TH17細(xì)胞，我是exFoxp3 TH17細(xì)胞，我的祖先是exFoxp3 T細(xì)胞，通過獲得了激活TH17變化而來的，跟其他TH17細(xì)胞就是不一樣哦!  （高唱：“我們不一樣！”）

Figure 4. exFoxp3 T_H17 cells are osteoclastogenic T cells with distinct gene profiles. 

第五問 我的家族在關(guān)節(jié)炎中有哪些“貢獻(xiàn)”

我的祖先是exFoxp3 T細(xì)胞，來自CD25loFoxp3+CD4+ T細(xì)胞家族，我們家族好像很厲害的樣子呢，讓我們一起來看一看它們對關(guān)節(jié)炎有哪些“貢獻(xiàn)”吧。

胸腺來源的穩(wěn)定的Foxp3+CD4+ T細(xì)胞與自身抗原有較高的親和力，維持了自身耐受性。作者假設(shè)不穩(wěn)定的Foxp3+CD4+T細(xì)胞也包含自我反應(yīng)T細(xì)胞，并且在失去Foxp3表達(dá)之后導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎發(fā)生。為了研究自身抗原特異性的exFoxp3 T細(xì)胞的作用，作者將CD25loFoxp3+、 CD25hiFoxp3+、Foxp3-、效應(yīng)記憶CD44hiFoxp3-CD4+T細(xì)胞（來源于膠原免疫的DBA/1 Foxp3hCD2小鼠）標(biāo)記CFSE，轉(zhuǎn)移到免疫小鼠模型中， CD25loFoxp3+細(xì)胞加速了關(guān)節(jié)炎發(fā)生，加重了癥狀。關(guān)節(jié)炎條件下，自身反應(yīng)CD4+ T 細(xì)胞主要來源于CD25loFoxp3+CD4+ T細(xì)胞（圖5a-c）。相比，CD25hiFoxp3+細(xì)胞顯著抑制了破骨細(xì)胞的生成，幾乎一半的CD25loFoxp3+細(xì)胞失去了Foxp3表達(dá)，幾乎全部CD25hiFoxp3+細(xì)胞仍表達(dá)Foxp3（圖5d）。體外二型膠原刺激后， CD25loFoxp3+細(xì)胞開始增殖，表明其包含更多的自身反應(yīng)T細(xì)胞（圖5e）。

Figure 5. Pathogenic role of exFoxp3 T cells to arthritis in vivo. 

場景：關(guān)節(jié)炎

主人公： ex Foxp3 T_H17細(xì)胞

我是ex Foxp3 T_H17細(xì)胞，屬于pT_reg細(xì)胞部落，從CD25loFoxp3+ CD4+ T細(xì)胞丟失Foxp3表達(dá)，聚集到關(guān)節(jié)，經(jīng)滑膜成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的IL-6轉(zhuǎn)變而來。表達(dá)Ccr6、CCL20、IL23R、RANKL是我的標(biāo)志，有較強(qiáng)的促破骨細(xì)胞發(fā)生能力，在關(guān)節(jié)炎的病理中有比較關(guān)鍵的作用。希望通過我的獨(dú)白大家能夠了解自身免疫關(guān)節(jié)炎中的發(fā)生機(jī)制和關(guān)鍵角色，我也能成為RA的標(biāo)志物，預(yù)測抗IL-6抗體的治療效果，進(jìn)而發(fā)展成為自身免疫疾病的新的治療手段。

本篇文章作者充分利用了基因編輯小鼠研究了自身免疫疾病的部分發(fā)生機(jī)制。很榮幸百奧賽圖起家第一桶金的產(chǎn)品鼠的IL-17a GFP KI小鼠對文章的研究有所幫助，如果您需要購買該小鼠或制備屬于您的專屬科研小鼠，請與我們聯(lián)系哦！

參考文獻(xiàn)：

1. Komatsu, N., Okamoto, K., Sawa, S., Nakashima, T., Oh-hora, M., Kodama, T., … Takayanagi, H. (2013). Pathogenic conversion of Foxp3+ T cells into TH17 cells in autoimmune arthritis. Nature Medicine, 20(1), 62–68.

2. Zhou, X., Jeker, L. T., Fife, B. T., Zhu, S., Anderson, M. S., McManus, M. T., & Bluestone, J. A. (2008). Selective miRNA disruption in T reg cells leads to uncontrolled autoimmunity. The Journal of Experimental Medicine, 205(9), 1983–1991. 

3. Zhou, X., Bailey-Bucktrout, S. L., Jeker, L. T., Penaranda, C., Martínez-Llordella, M., Ashby, M., … Bluestone, J. A. (2009). Instability of the transcription factor Foxp3 leads to the generation of pathogenic memory T cells in vivo. Nature Immunology, 10(9), 1000–1007.