小編：天地悠悠過客匆匆潮起又潮落~~~

小鼠甲：咳咳，咱們是個嚴(yán)肅的科普節(jié)目……

小編：天地洪荒，宇宙萬物，生命起源，又到了萬物~~~

小鼠乙：（咆哮體）現(xiàn)在是冬天！冬天！咱們幾（今）天要講的是細(xì)胞！細(xì)胞！

小編：呃(⊙o⊙)… 好吧，咱們今天要講的是細(xì)胞(*^▽^*)，大家都知道細(xì)胞在發(fā)育過程中其命運是被嚴(yán)格控制的，以確保每個細(xì)胞能以和諧的方式發(fā)揮它的生理功能。一些重要的細(xì)胞因子參與其中，好像上帝的指令一樣，決定了不同細(xì)胞的命運，很多科學(xué)家也在孜孜不倦的探索其中的奧秘。今天就為大家?guī)�來一個關(guān)于B細(xì)胞重新編程為T細(xì)胞的精彩故事^_^且聽我慢慢講來[1] ……

目前已經(jīng)有很多研究證明通過特定轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)可以將多能或多能細(xì)胞導(dǎo)向分化成特定類型的細(xì)胞或從一個譜系轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪粋�譜系。比如Gata1的表達(dá)將單核細(xì)胞前體轉(zhuǎn)化為紅系-巨核細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞[2-4] ，Cebpα將B細(xì)胞轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞[5]; 刪除Pax5將B細(xì)胞轉(zhuǎn)化為未定型的造血祖細(xì)胞[6,7]; Gata3的表達(dá)將T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肥大細(xì)胞[8]; Cebp±和Spi1的表達(dá)將T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞[9]，Bcl11b的缺失將T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為自然殺傷樣細(xì)胞[10]。但是嘗試通過沉默B細(xì)胞關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，將B轉(zhuǎn)換為T細(xì)胞只取得了有限的成功，因為無法在功能上重建整個T細(xì)胞譜系，并且在某些情況下，這種操作會增加癌化的風(fēng)險[6,7,11,12]。但通過以往這些研究，總的來說造血細(xì)胞的命運是可以通過基因操作來改變的。

但是到底是哪些轉(zhuǎn)錄因子重點參與了細(xì)胞間的轉(zhuǎn)化呢？

15個轉(zhuǎn)錄因子的異常表達(dá)與B細(xì)胞重編程為T細(xì)胞相關(guān)

為了找到這些關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，研究人員首先采用RNA-Seq鑒定了成熟完全定型的譜系細(xì)胞與Hematopoietic stem cells（HSC）和multipotent progenitors（MPP）中差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。如果基因在HSC和MPP中的相對表達(dá)量比在譜系細(xì)胞中高2倍(P< 0.05)，則被指定為在HSC和MPP中差異表達(dá)的基因。研究人員篩選出15個在造血干祖細(xì)胞高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，它們在HSC和MPP中表達(dá)，但未在譜系定型的細(xì)胞中表達(dá)[圖1] ，研究人員推斷這些因子在Pro-pre-B細(xì)胞中過表達(dá)有可能改變該細(xì)胞類型的命運。

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候選基因初步篩選出來了！我們?nèi)绾悟炞C這一推斷呢？

科學(xué)家們將15種轉(zhuǎn)錄因子中的每一種克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體中，調(diào)整成相同的感染滴度后，混合感染純化過的Pro-pre-B細(xì)胞[圖2a]，使感染的Pro-pre-B細(xì)胞表達(dá)GFP熒光蛋白（TFs），以感染表達(dá)GFP空載體的Pro-pre-B細(xì)胞為對照（Ctr）[圖2b] ，然后移植到清髓預(yù)處理的野生型受體小鼠[圖2d]。移植后四周，發(fā)現(xiàn)部分受體鼠胸腺中出現(xiàn)GFP標(biāo)記的T淋巴細(xì)胞[圖2c]。對GFP+胸腺細(xì)胞的流式細(xì)胞分析顯示存在CD44+CD25-CD4-CD8- DN1、CD44+CD25+ DN2、CD44-CD25+ DN3和CD44-CD25- DN4的雙陰性胸腺細(xì)胞（DN），CD4+CD8+雙陽性胸腺細(xì)胞（DP），CD4+CD8-單陽性T淋巴細(xì)胞和CD8+CD4-單陽性T淋巴細(xì)胞（SP）[圖2e]。

說明這候選的15種轉(zhuǎn)錄因子中，存在具有調(diào)控B細(xì)胞向T細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用的轉(zhuǎn)錄因子�？墒沁@15種候選轉(zhuǎn)錄因子中的哪一種誘導(dǎo)B至T細(xì)胞轉(zhuǎn)化呢？

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Hoxb5的過表達(dá)將B細(xì)胞重編程為T細(xì)胞

為了找到15種候選轉(zhuǎn)錄因子中的哪一種誘導(dǎo)B至T細(xì)胞轉(zhuǎn)化，研究人員進(jìn)一步縮小篩選范圍。將上述實驗中得到得到GFP+胸腺細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞PCR測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些胸腺細(xì)胞大致可以分為這三類病毒來源：1.表達(dá)Hoxb5的逆轉(zhuǎn)錄病毒（retro-Hoxb5）；2.表達(dá)14轉(zhuǎn)錄因子但缺乏Hoxb5（14-TF）；3. 只表達(dá)GFP的對照的病毒。結(jié)果顯示，在所有retro-Hoxb5-pro-pre-B細(xì)胞受體小鼠（以下稱retro-Hoxb5小鼠）中，超過65％的胸腺有核細(xì)胞是Ter119-Mac1-CD19-GFP+，而在14-TF或pro-pre-B細(xì)胞轉(zhuǎn)移的小鼠中未檢測到[圖3a]。在移植后4周和8周時，能夠在retro-Hoxb5小鼠外周血（PB），脾和淋巴結(jié)（LN）中檢測到GFP+CD4+和GFP+CD8+成熟T細(xì)胞，隨后在PB中12周降低和消失[圖3b]。GFP+ T細(xì)胞包括TCRβ+和TCRγδ+細(xì)胞。

此外，研究者從15-TF小鼠中分選GFP+胸腺細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測序,結(jié)果證明上述細(xì)胞在單細(xì)胞水平同時含有B細(xì)胞BCR的Ig重鏈V(D)J和T細(xì)胞TCRβ的V(D)J重組現(xiàn)象 [數(shù)據(jù)未展示] 。

這些數(shù)據(jù)表明，Hoxb5有可能是調(diào)控B細(xì)胞向T細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子。那么我們?nèi)绾芜M(jìn)一步確定這樣的結(jié)果呢？而且在上述的實驗中，Hoxb5的組成型表達(dá)是否有影響到T、B細(xì)胞的發(fā)育呢？

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為了排除這些影響，并驗證上述實驗結(jié)果�？蒲腥藛T構(gòu)建了一個關(guān)鍵的工具小鼠：Hoxb5LSL/+[圖4a]。利用這個小鼠與特異性的Cre小鼠交配，得到兩種組織特異性表達(dá)Hoxb5（并同時表達(dá)EGFP）的小鼠：1. Vav-Cre,Hoxb5LSL/+，造血細(xì)胞中特異性表達(dá)Hoxb5簡稱Vav-Hoxb5-GFP小鼠；2.CD19-Cre, Hoxb5LSL/+ ,B細(xì)胞中特異性表達(dá)Hoxb5簡稱CD19-Hoxb5-GFP小鼠。首先對這兩種小鼠進(jìn)行基本的流式分析檢測，結(jié)果顯示：1. CD19-Hoxb5-GFP小鼠顯示出與來自同窩對照Hoxb5LSL/+相當(dāng)?shù)陌l(fā)育模式[圖4b、c] ；2.與Hoxb5LSL+對照小鼠相比Vav-Hoxb5-GFP小鼠中所有造血細(xì)胞，包括T淋巴細(xì)胞，小鼠的骨髓和胸腺中的ETP（early T cell progenitors）比例相當(dāng) [圖4f] 。胸腺中的DN和DP細(xì)胞[圖4d] ，以及PB，脾，LN和BM中的CD4+和CD8+ T淋巴細(xì)胞的比例也相當(dāng) [圖4e]。

這說明Hoxb5的組成型表達(dá)對B、T細(xì)胞發(fā)育影響都較小。

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B細(xì)胞特異性表達(dá)Hoxb5可以將B細(xì)胞重編程為T細(xì)胞

對CD19-Hoxb5-GFP小鼠進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，外周血中約90％的CD19+ B淋巴細(xì)胞表達(dá)GFP-Hoxb5，而PB中的CD3+ T淋巴細(xì)胞或Mac1+骨髓細(xì)胞不表達(dá)GFP[圖5a]。然而在小鼠4w、8w、12w的胸腺中卻能檢測到GFP+ T淋巴細(xì)胞 [圖5b] 。

在將CD19-Hoxb5-GFP小鼠BM分離的pro-pre-B細(xì)胞移植到經(jīng)輻照預(yù)處理的野生型同品系受體小鼠中。移植后4周胸腺中>30％的T淋巴細(xì)胞為GFP+[圖5c]，脾臟中>10％的T淋巴細(xì)胞[圖5d]和LN中的>7％[圖5e]是GFP+。 這些結(jié)果表明Hoxb5特異性表達(dá)將B重編程為T細(xì)胞。

仿佛聽到Hoxb5在說：你現(xiàn)在雖然是B淋巴細(xì)胞，但是只要同時表達(dá)了我Hoxb5，不久后你就會變成T細(xì)胞哦！厲不厲害？

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Hoxb5誘導(dǎo)的T細(xì)胞在功能上等同于野生型T細(xì)胞

好了，我們已經(jīng)確定了Hoxb5確實在B細(xì)胞向T細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程中起關(guān)鍵的作用，那么我們得到再生的T細(xì)胞是否是有功能的呢？帶著這一問題，我們看看科研人員又做了哪些工作？

為了評估成熟再生的T細(xì)胞（iT）的功能，研究者將retro-Hoxb5 pro-pre-B細(xì)胞移植到經(jīng)過亞致死輻射的（3.5Gy）Rag1-/-（C57BL/6背景，缺乏B細(xì)胞和T細(xì)胞）受體小鼠中。3周后能夠在Hoxb5-Rag1-/-小鼠PB中檢測到GFP+ iT淋巴細(xì)胞[圖6a]。將Hoxb5-Rag1-/-小鼠中GFP+脾細(xì)胞分離后，體外用CD3和CD28抗體培養(yǎng)6天，檢測到各細(xì)胞因子比例與野生型比較無差異[圖6b、c]。進(jìn)一步異體皮膚移植模型證明，利用iT細(xì)胞重建的Rag1-/-小鼠，能夠排斥異體皮膚移植物（BALB/c 背景）。比如在移植部位形成的凸起，潰瘍和壞死病變 [圖6d] ，免疫熒光實驗結(jié)果顯示同種異體移植皮膚的真皮層能夠檢測到GFP+CD3+ iT淋巴細(xì)胞浸潤[圖6e]。

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iT細(xì)胞的功能是否包含獲得免疫記憶功能呢？研究人員在異種皮膚移植時隔8周后，對初次皮膚排斥反應(yīng)的小鼠進(jìn)行了二次異體皮膚移植。結(jié)果表明iT細(xì)胞產(chǎn)生了免疫記憶功能，能夠在更短地時間內(nèi)發(fā)生免疫應(yīng)答，排斥二次移植的異體皮膚組織[圖7a] 。流式分析排斥的皮膚組織制備的單細(xì)胞群發(fā)現(xiàn)排斥部位存在浸潤激活的CD44higCD69+的CD4+ SP和CD8 SP+ T細(xì)胞[圖7b] ，并且含有能夠分泌INFγ和IL-17的CD4+ SP，以及能夠分泌INFγ 的CD8+ SP T細(xì)胞[圖7c] 。因此，上述重編程再生的T細(xì)胞具備獲得性免疫記憶功能。

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B細(xì)胞重編程為T細(xì)胞過程中Hoxb5是瞬時表達(dá)的

當(dāng)~當(dāng)~當(dāng)……

重點又來啦��！ Hoxb5確實指導(dǎo)了B細(xì)胞向T細(xì)胞重編程，并且再生的T細(xì)胞也具有功能。​那么再生的T細(xì)胞是否依然需要Hoxb5的表達(dá)維持其生理功能呢？

為了研究這一機制，研究人員又構(gòu)建了條件性誘導(dǎo)表達(dá)的Hoxb5小鼠模型(Tet-on Hoxb5-BFP) [圖8a]，此小鼠在用DOX誘導(dǎo)下能夠表達(dá)Hoxb5，停止飼喂DOX則關(guān)閉Hoxb5表達(dá)。在Tet-Hoxb5小鼠飲用水中添加DOX一周后，在小鼠BM中能檢測到BFP+ pro-pre-B細(xì)胞[圖8c] 。之后將BM BFP+ pro-pre-B細(xì)胞轉(zhuǎn)移到輻照過的NOD-SCID小鼠中（以下稱為Tet-Hoxb5-NOD-SCID小鼠）并持續(xù)飼喂DOX飲水。轉(zhuǎn)移后4,8和12周時檢測受體鼠在PB，LN，脾和胸腺都含有供體細(xì)胞來源的T細(xì)胞[圖8d、e]，在轉(zhuǎn)移后4周時檢測到超過95％的供體來源的T細(xì)胞是BFP-[圖8f]。如果Tet-Hoxb5-NOD-SCID小鼠連續(xù)喂DOX藥水兩周后停止喂藥[圖8b]，則4周后檢測發(fā)現(xiàn)PB和脾中的所有T淋巴細(xì)胞都是BFP- [圖8e] 。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)BFP+細(xì)胞表達(dá)Hoxb5，而BFP-細(xì)胞與野生型一樣不表達(dá)Hoxb5 [圖8g] 。

這些結(jié)果證明體內(nèi)2周的Hoxb5表達(dá)就可以成功地將B細(xì)胞重編程為T細(xì)胞，之后不再需要Hoxb5持續(xù)性表達(dá)來維持T淋巴細(xì)胞在胸腺的進(jìn)一步發(fā)育成熟。單細(xì)胞測序分析表明上述重編程來源的T細(xì)胞都含有免疫球蛋白重鏈VDJ重排序列，證明起源于B細(xì)胞[數(shù)據(jù)不再展示]。

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重編程的機制研究：Hoxb5將B細(xì)胞轉(zhuǎn)化為ETP

那么，B細(xì)胞重編程為T細(xì)胞過程中Hoxb5是從哪開始起作用的呢？

研究人員進(jìn)一步探索重編程中否將pro-pre-B細(xì)胞直接重編程為ETP（iETP， early T cell progenitors ）。他們分析了retro-Hoxb5小鼠中BM和胸腺中Lin-CD44+c-kithiCD25- iETP [圖9a]的細(xì)胞學(xué)動態(tài)學(xué)。結(jié)果顯示，在移植后第2周至第6周，在retro-Hoxb5小鼠的BM中檢測到GFP+iETP [圖9b] ，移植后約3周達(dá)到最大豐度。 BM-ETP在轉(zhuǎn)錄組學(xué)水平顯示還殘留Pro-pre-B細(xì)胞的部分基因表達(dá)特征[圖9c] 。在胸腺中移植后第4周檢測到最大豐度[圖9b]，轉(zhuǎn)錄組水平顯示已經(jīng)完全關(guān)閉Pro-pre-B特異表達(dá)基因（如Pax5, EBF1, CD19） [圖9c] 。

為了驗證胸腺中iETP能夠分化為成熟T細(xì)胞，研究人員分離了iETP，進(jìn)行了胸腺內(nèi)二次移植實驗。結(jié)果顯示ETP可以在受體鼠胸腺發(fā)育成熟為CD4+ SP和CD8+ SP T細(xì)胞，并且成功分布到脾臟，淋巴結(jié)和外周血[圖9d] 。因此，Hoxb5是在骨髓中將B細(xì)胞重編程為 T淋巴祖細(xì)胞（重編程中間態(tài)細(xì)胞），之后在胸腺中完成重編程，產(chǎn)生有功能的T淋巴祖細(xì)胞，再發(fā)育產(chǎn)生成熟T細(xì)胞。

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Hoxb5靶向B、T細(xì)胞調(diào)節(jié)因子和染色質(zhì)修飾因子

最后，研究人員還通過RNA-Seq和CHIP-Seq實驗對比分析了表達(dá)Hoxb5和表達(dá)GFP對照的Pro-pre-B細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和表觀組學(xué)特征。Hoxb5在pro-pre-B細(xì)胞中的表達(dá)改變了許多與染色質(zhì)修飾相關(guān)的基因的表達(dá)，包括表觀遺傳修飾因子Hdac9，Ezh1，Ldb1，Cbx8和Asxl1 [圖10a]，與B到T細(xì)胞重編程過程基因表達(dá)模式的改變一致。重要的是，早期B細(xì)胞發(fā)育所必需的轉(zhuǎn)錄因子，如Ebf1，Bcl11a，F(xiàn)oxp1和Foxo1 被Hoxb5抑制，而對T細(xì)胞發(fā)育或功能至關(guān)重要的Nfatc1，Tcf12， Lmo2和Prdm1在pro-pre-B細(xì)胞中被Hoxb5激活[圖10b] 。

GSEA（Gene set enrichment analysis ）分析表明，與感染空載體相比，retro-Hoxb5 pro-pre-B細(xì)胞中對B細(xì)胞發(fā)育必需的Ikzf1（Ikaros）和Pax5被顯著抑制[圖10c、d]，而且遺傳修飾因子Kmt2a（Mll）（一種對HSC自我更新重要的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶）也被顯著抑制[圖10e] 。

這些結(jié)果表明，pro-pre-B細(xì)胞中Hoxb5的表達(dá)抑制B細(xì)胞譜系特異性轉(zhuǎn)錄因子和特征基因的表達(dá)，增強與T細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和基因的表達(dá)，從而實現(xiàn)誘導(dǎo)B細(xì)胞到T細(xì)胞的命運轉(zhuǎn)化。

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好了，總之研究人員揭示了轉(zhuǎn)錄因子Hoxb5的表達(dá)能夠在體內(nèi)將Pro-pre-B細(xì)胞重編程為有生理功能的T細(xì)胞。Hoxb5通過抑制B細(xì)胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子、激活T細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子、調(diào)控表觀遺傳相關(guān)分子，從而實現(xiàn)B細(xì)胞到T細(xì)胞的命運改變。

這時候，仿佛又聽到Hoxb5在傲嬌的說：單單靠我一個轉(zhuǎn)錄因子，在B細(xì)胞中維持短短2周的表達(dá)，就可以抑制一堆B細(xì)胞特異的基因，促進(jìn)一堆T細(xì)胞特異的基因，直接把B細(xì)胞變成了T細(xì)胞了，而且是記憶力很好的T細(xì)胞，有獲得性免疫記憶功能哦！我膩不膩害？ 

故事終于講完了~~~小編要喝口水~~~接著廣告時間到�。。�！

大家還記得故事里用到的很重要的工具小鼠嗎？ Hoxb5LSL/+ 小鼠（條件性過表達(dá)），Tet-on Hoxb5-BFP小鼠（誘導(dǎo)型條件性過表達(dá)），他們都是由百奧賽圖構(gòu)建的哦，如果您有基因編輯模式動物的需求歡迎聯(lián)系我們^_^

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