一、核酸提取技術(shù)的改進

        中國微生物菌種查詢網(wǎng) 進行分子生物學研究的前提是取得高數(shù)量和高質(zhì)量的核酸，即DNA和RNA。由于隱球菌細胞壁外有一層厚厚的莢膜，為破除真菌細胞壁造成很大困難�？煽康靥崛‰[球菌DNA的方法建立于20世紀80年代后期，研究者先后建立了玻璃珠方法、超聲粉碎、液氮冷凍研磨等破壁技術(shù)。后來，發(fā)展酶學方法取代物理方法，用生物酶消化莢膜和細胞壁、制備原生質(zhì)體，然后再用去污劑溶解細胞膜、釋放DNA。目前常用的酶為Novozyme234，具有1，3-a-及1，3-b-萄聚糖酶、幾丁質(zhì)酶、蛋白酶、地衣酶、木聚糖酶等多種活性，破壁效果好。另外新生隱球菌能夠產(chǎn)生細胞外DNA酶，在反應體系中始終保持高濃度的EDTA，可以有效地抑制DNA酶，防止DNA被降解。

二、基因克隆

已掌握的新生隱球菌的遺傳圖譜相當少，而且也相當不精確。目前還沒有完成新生隱球菌全基因組的序列測定，只確定和報道了少數(shù)基因在染色體上的定位。

1、毒性基因
新生隱球菌的主要致病因素有四個：多糖莢膜、產(chǎn)黒色素、a接合型和37℃能存活。Still和Chang等應用經(jīng)典的遺傳學方法和基因互補技術(shù)分離，并鑒定了參于莢膜形成的基因----CAP59, 該基因編碼458個氨基酸，含有6個內(nèi)含子，經(jīng)雜交分析確定CAP59基因定位于新生隱球菌的染色體Ⅰ上。二個克隆的莢膜形成必需基因----CAP64，其DNA全長1.9kb，預計編碼522個氨基酸，有8個內(nèi)含子，定位于染色體Ⅲ上。新生隱球菌的產(chǎn)黒素基因----CNLAC1也已克隆，該基因編碼642個氨基酸，含14個內(nèi)含子。a-接合型和a-接合型是一對等位基因，與新生隱球菌的性生殖有關(guān)，遺傳公析顯示a-接合型和菌株毒性增加存在關(guān)聯(lián)，Moore等應用差異克隆技術(shù)獲得了a-接合型相關(guān)基因----MFa,內(nèi)含一個零擁有114bp的開放閱讀框架（ORF)。

2、結(jié)構(gòu)基因
Edman等應用大腸桿菌互補技術(shù)克隆了編碼新生隱球菌乳清酸核苷-單磷酸-焦磷酸化酶（OMPase）的基因----URA5，該基因包括675個核苷酸和2個內(nèi)含子，定位于1500kb左右的染色體上。Varma等經(jīng)動物實驗證實URA5陰性突變株其毒性明顯降低，可見URA5基因與新生隱球菌的致病能力有關(guān)。Edman等隨后克隆了編碼新生隱球菌磷酸核糖胺咪唑羧化酶的基因----ADE2，磷酸核糖胺咪唑羧化酶參于嘌呤的生物合成，而在許多微生物中嘌呤代謝和菌株致病性間存在強烈的關(guān)聯(lián)。ADE2基因有望成為探索抗真菌治療的一個突破口。胸苷酸合成酶催化還原性甲基化反應，在DNA生物合成中起關(guān)鍵作用。Livi等應用PCR技術(shù)克隆了編碼新生隱球菌胸苷酸合成酶的基因----CnTS，并測到了基因序列，克隆的CnTS基因長1127kp，有3個內(nèi)含子和1個951bp的ORF,編碼一分子量為35844Da的蛋白質(zhì)。rRNA是生物進化的高度保守基因，編碼新生隱球菌4種rRNA分子即5.8s、18s、25s和5s rRNA的基因均已得到克隆，它們在 rRNA基因簇中的排列次序也已確定，即為5s-18s-5.8s-25s。Fan等認為rRNA各亞基在兩個變種中順序一致，且5s rRNA的大小均為118堿基。Perfect等對新生隱球菌的rRNA基因進行染色體定位，發(fā)現(xiàn)不同株隱球菌的rRNA基因定位于不同大小的染色體，其分布范圍從大于1130kb到小于2000kb。

3、調(diào)控基因
為了仔細分析CAP59基因的功能區(qū)，Chang等將CAP59基因置于隱球菌GAL7啟動子（pGAL7）控制之下，在數(shù)個組成不同的GAL7:CAP59融合基因中，只有一個含有完全CAP開放閱讀框架的基因能在半乳糖誘導下轉(zhuǎn)化無莢膜突變株，形成莢膜。這說明整個開放閱讀框架是CAP59編碼蛋白質(zhì)所必需的。為了研究新生隱球菌肌動蛋白基因的調(diào)控機理，Toffalettit等將新生隱球菌肌動蛋白基因（ACT）的啟動子和大腸桿菌（E.coli）的報告基因----b-半乳糖苷酶基因（LACZ）融合起來，構(gòu)建了一個表達質(zhì)粒----ACTp:LACZ，通過在體外檢測b-半乳糖苷酶的活性來判斷肌動蛋白啟動子的功能。結(jié)果，重組子表達b-半乳糖苷酶的活性，在對數(shù)生長期和在隱定生長期是有差別的，又都表現(xiàn)出溫度信賴性，即在37℃培養(yǎng)條件下比在30℃培養(yǎng)條件下在更高的表達活性。提示隱球菌肌動蛋白基因受溫度調(diào)控，同時作者推測還有其它隱球菌基因也受溫度調(diào)控，這就解釋了為什么“37℃能存活”成為隱球菌致病因素之一。人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，真菌基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)不同于哺乳動物或植物，但Zhang等在研究新生隱球菌毒性基因----CNLAC1的同時，卻發(fā)現(xiàn)它的調(diào)控機理非常相似于哺乳動物或植物，即通過阻斷轉(zhuǎn)錄起點上游區(qū)域多個DNA結(jié)合位點和利用富含谷氨酸的增強子（如Sp1）來達到調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的目的。

三、分子流行病學

對于感染性疾病來說，流行病學資料是非常重要的。它是確定感染源和傳播途徑的重要基礎(chǔ)，也是制定群體預防措施的重要依據(jù)。早在20世紀80年代末和90年代初，就已應用分子技術(shù)對新生隱球菌進行分型研究。這些分子流行病學實驗方法包括：多位點酶電泳分型、脈沖電場凝膠電泳核型分析、限制性片段長度多態(tài)分析（RFLPs）DNA指紋圖譜、線粒體DNA探針和隨機擴增多態(tài)性DNA分析（RFPD）等。
盡管在體外培養(yǎng)時，臨床分離株和環(huán)境分離株的帶型是相對隱定的，但新生隱球菌在一定的環(huán)境壓力下還是表現(xiàn)出遺傳的多態(tài)性。某些菌株的基因型與生俱來就不如其他菌株隱定。這種快速變化的遺傳多態(tài)性，在微衛(wèi)星水平和大片段DNA水平（染色體）都有所表現(xiàn)。因此在使用非常敏感的基因分型方法時，需要考慮新生隱球菌在一定的環(huán)境和宿主壓力下微進化的現(xiàn)象。

RAPD分析是一種利用隨機合成的單個寡核苷酸引物通過PCR反應擴增靶細胞DNA。擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳，分析DNA片段大小和數(shù)量多態(tài)性，從而比較靶基因差異的一種技術(shù)。RAPD自1990年問世以來，已陸續(xù)用于酵母菌和絲狀真菌的定型、分類和流行病學研究。這一方法適用于真菌各秩級的分類學研究，因為真菌基因組龐大，RAPD能對整個基因組序列做大致的分析，特別適用于分子生物學研究甚少、不了解基因組DNA序列的真菌。它借用的基本方法是PCR技術(shù)，操作簡便、迅速，便于大規(guī)模使用。

Meyer等用（GTG）5、（GACA）4和噬菌體M13編碼順序（GAGGTGCGGCTCT）作為RAPD的隨機單引物，對42株新生隱球菌進行研究。發(fā)現(xiàn)RAPD標志（亦稱PCR指紋）具有高度重復性，且在種、變種和單個菌株水平上存在差異。新生隱球菌新生變種的A、D血清型的指紋截然不同，而格特變種的B、C血清型其指紋則不易區(qū)分。格特變種的兩種血清型比新生變種的兩種血清型在遺傳學上更為同源。溫海等用（GTG）5、（GACA）4和（GATA）4為引物，PCR擴增30株來自意大利米蘭的新生隱球菌臨床分離株和野生株、12株來自中國上海的臨床分離株標準株。結(jié)果能清晰地區(qū)分隱球菌的不同種、不同血清型及相同血清型的不同株，與Meyer的報告相似。顧菊林等以（GACA）4作為RAPD的隨機單引物，分析了11株新生隱球菌標準株和14株新生隱球菌臨床分離株，結(jié)果顯示（GACA）4引物產(chǎn)生的PCR指紋在新生隱球菌的種、血清型和株水平上呈現(xiàn)明顯特征性差異。實驗還發(fā)現(xiàn)1例隱球菌復發(fā)病例，其初始分離株和復發(fā)分離株其PCR指紋相同，說明為同一菌株，提示隱球菌的復發(fā)是原始菌株的復燃所致，而不是新菌株的感染所為。作者認為RAPD分析可以發(fā)展為一種對新生隱球菌進行分類鑒定和流行病學調(diào)查的工具。

盡管序列測定非�；ㄙM時間，但特殊的基因序列分析已被用來檢測新生隱球菌的多態(tài)性和區(qū)分不同菌株�，F(xiàn)已明確新生隱球菌菌株之間存在DNA序列變化。例如，單拷貝的URA5基因在單個菌株和兩個變種之間就有廣泛的堿基對替換，最高可達基因編碼序列的6%。堿基對的替換通常發(fā)生在密碼子的第三個核苷酸或是在內(nèi)含子部份，因此蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)并沒有發(fā)生改變。重組的新生隱球菌拓撲異構(gòu)酶Ⅰ基因，其堿基順序在血清A 型株T 在型株之間存在著3.6%的差異。有實驗證明，新生隱球菌具有基因替換重組能力。在新生隱球菌多基因家族的補充調(diào)查研究中，發(fā)現(xiàn)有兩個泛素基因，UBⅠ1和UBⅠ2，位于不同的染色體上。對其進行序列測定，發(fā)現(xiàn)兩個基因的重復片段的核苷酸序列有很大的差異（大約有15%）,包括編碼位點和內(nèi)含子數(shù)目也存在差異。重復序列發(fā)生如此高頻率的重組，其確切機制目前還沒有闡明。事實上，還不了解是否存在或存在多大程度的甲基化，才可能影響新生隱球菌的基因表達，和/或改變RFLP帶型。但是，從序列資料的研究中已明確新生隱球菌存在許多的基因轉(zhuǎn)化和/或重組事件，依此可建立基因序列水平上鑒定菌株的敏感方法。

作為最終分析結(jié)果，用幾種不同的分子生物學技術(shù)對新生隱球菌進行鑒定是明智之舉。Brandt和美國隱球菌監(jiān)測組在鑒定33株隱球菌時，采用了多位點酶電泳、電泳核型、RADP技術(shù)和CNRE-1探針等多種方法，發(fā)現(xiàn)技術(shù)方法和分離菌株之間有一定的相關(guān)性，在一個方法中出現(xiàn)的差異可以用另外一種方法補償糾正。必須強調(diào)的是，選擇不同技術(shù)方法時要注意到，能夠真正地檢測到感染導致菌株微進化的方法和缺乏鑒別菌株差異的方法之間的平衡�？傊�，多種分析技術(shù)聯(lián)合應用可以很好地鑒別新生隱球菌。

四、分子診斷

早期的檢測手段主要是DNA探針技術(shù)。習慣上總是盡量選擇基因組中拷貝數(shù)較高的序列做探針，這樣的探針具有較高的敏感性，所以都選擇重復序列片段作為DNA探針，如rDNA探針。自PCR技術(shù)誕生之后，用DNA探針直接進行DNA-DNA雜交的做法便被淘汰。從理論上講，PCR技術(shù)可檢測到單個菌細胞。現(xiàn)在通常的作法是將DNA探針用作PCR反應中的靶DNA，經(jīng)過引物設(shè)計，直接建立PCR診斷方法。
Polacheck等以pBluescript SK質(zhì)粒為載體，以大腸桿菌DH5為宿主，構(gòu)建了血清D型新生隱球菌基因文庫，從中篩選獲得一段1.0kb的種特異性的中度重復順序及300bp的特異性的DNA片段。吳建華等以pUC18為載體，以大腸桿菌JM103為宿主，構(gòu)建了血清A型標準株DNA克隆庫，并從中篩選出了3個特異性片段：種特異性、變種特異性和A型特異性片段。其中種特異性探針為多拷貝序列，長500bp左右，適合用于PCR反應模板。顧菊林等建立套式PCR檢測隱球菌：應用雙引物系統(tǒng)進行套式PCR擴增，第一步應用外側(cè)引物可以診斷常見的病原真菌，能對代表8屬17種的25株醫(yī)學真菌進行擴增，而對所有細菌和人DNA均為擴增陰性；第二步應用內(nèi)側(cè)引物僅對新生隱球菌獲得擴增，11株新生隱球菌均為擴增產(chǎn)生預期長度136bp的特異性片段，21株非新生隱球菌擴增陰性。作者用上述方法對保藏的37份CSF標本進行了回顧性研究，結(jié)果表明，若以涂片法或/和真菌培養(yǎng)陽性作為判別有無新生隱球菌存在的“0金標準”，PCR檢測法的敏感性為100%，而真菌培養(yǎng)的敏感性僅為74%.PCR法檢測的特異性為93%，與傳統(tǒng)方法檢測結(jié)果有較好的符合率。

五、分子種系發(fā)生學

隨著基因組研究的不斷成熟，應用DNA序列信息將更有力地說明真菌之間的種系發(fā)生關(guān)系。高度保守的rRNA和rDNA是分子種系發(fā)生學研究的重點，新生隱球菌的這些基因序列已被進行了研究。在新生隱球菌中，在8kb的重復DNA片段中，按順序排列著16s、5.8s、23s基因，而且按照同樣的方向轉(zhuǎn)錄。Fan測定了新生隱球菌的16s和23s rRNA基因序列，并且利用這些序列建立了新生隱球菌和其它真菌之間的系統(tǒng)進化樹狀圖。Gueho通過分析rRNA大亞基最可變區(qū)的部份序列，構(gòu)建了新生隱球菌與屬內(nèi)其他種隱球菌的親緣關(guān)系進化樹狀圖。在這個種系發(fā)生樹狀圖上，可以發(fā)現(xiàn)新生線狀黒粉菌血清A型和其他3個血清型相比有細微的進化差異，有人推論它可能是按照不同的進化速率發(fā)展的。

目前的研究主要集中在，研究其他基因及分析其祖先起源上。Cox等通過分析高度保守的肌動蛋白基因，調(diào)查了新生隱球菌的種系發(fā)生學關(guān)系，用這個基因序列可以將新生隱球菌歸類到真菌進化的一個單獨分支，但是還需要測定更多的其他真菌的肌動蛋白基因序列來進行深入的亞群比較，并利用龐大的rRNA數(shù)據(jù)庫資料進行對照修正。

隱球菌分子進化研究的另一個有意義的用途是確定相關(guān)菌種間特異性遺傳毒力因子的差異。新生隱球菌是新生線狀黒粉菌的無性世代，是線狀黒粉菌科中唯一的有動物致病性的菌種，也是擔子菌中主要的人類致病菌。如現(xiàn)有的研究工作發(fā)現(xiàn)，用探針和其他異種擔子菌基因組雜交時，不能檢測到新生隱球菌莢膜基因（CAP59）和漆酶基因（CnLAC1）,在能夠產(chǎn)生莢膜的菌種中，如銀耳、羅倫特隱球菌，也沒有發(fā)現(xiàn)與CAP59同源的基因。同樣用產(chǎn)黒素的CnLAC1基因作探針與其他幾種異種擔子菌雜交，也不能發(fā)現(xiàn)同源基因。這些結(jié)果提示，編碼莢膜和漆酶的原始基因要么在進化的早期就已形成，要么是一群相關(guān)的真菌為適應不同生態(tài)壓力產(chǎn)生的明顯分岐。為了進一步了解其他異種擔子菌和致病性新生隱球菌的親緣關(guān)系，可以對毒性因子的進化進行深入研究。

Boekhout等用一系列分子生物學分型方法研究了新生隱球菌兩個變種的環(huán)境、動物和臨床分離株，結(jié)果兩個變種在染色體數(shù)目和大小、RAPD等方面存在著顯著的差異，這些差異使得Boekhout懷疑兩個變種其實代表不同的種。目前許多爭論，認為新生變種和格特變種具有獨立的特性，它們的基因型的確存在著明顯的差異，深入的分子生物學研究也證明這兩個變種之間存在著遺傳學上的交叉。