普通 PCR、實時熒光定量 PCR 和數(shù)字 PCR 對比分析
1985 年，美國 PE-Cetus 公司的 Mullis 等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），實現(xiàn)了在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的 DNA 復(fù)制。然而，采用 E-coli DNA 聚合酶進(jìn)行 PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時，費力，且易出錯。1988 年 Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌 (thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱 DNA 聚合酶。 耐熱 DNA 聚合酶的應(yīng)用使得 PCR 能高效率的進(jìn)行，隨后 PE-Cetus 公司推出了第一臺 PCR 自動化熱循環(huán)儀，從此拉開了 PCR 大展拳腳的序幕。
根據(jù) PCR 的發(fā)展進(jìn)程，本文將對普通 PCR、實時熒光定量 PCR 和數(shù)字 PCR 這三代 PCR 進(jìn)行分析，期望對 PCR 感興趣的讀者能從中有所收獲。
普通 PCR
基本原理
PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）是一種體外 DNA 擴增技術(shù)，是在模板 DNA、引物和 4 種脫氧核苷酸存在的條件下，依賴于 DNA 聚合酶的酶促合反應(yīng)，將待擴增的 DNA 片段與其兩側(cè)互補的寡核苷酸鏈引物經(jīng)「高溫變性—低溫退火 —引物延伸」三步反應(yīng)的多次循環(huán)，使 DNA 片段在數(shù)量上呈指數(shù)增加，從而在短時間內(nèi)獲得我們所需的大量的特定基因片段。DNA 的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。
PCR 反應(yīng)體系舉例
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10×擴增緩沖液 |
10µl |
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4 種 dNTP 混合物 |
各 100～250μmol/L |
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引物 |
各 5～20μmol/L |
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模板 DNA |
0.1～2µg |
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Taq DNA 聚合酶 |
5~10U |
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Mg2+ |
1～3mmol/L |
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加雙或三蒸水至 |
100µl |
儀器與耗材
基于聚合酶制造的 PCR 儀實際就是一個溫控設(shè)備，能在變性溫度、復(fù)性溫度和延伸溫度之間很好地進(jìn)行控制。這些儀器主要用變溫鋁塊、變溫水浴及變溫氣流的方式達(dá)到熱循環(huán)的目的，各有其優(yōu)缺點，在此不再贅述。
結(jié)果檢測
PCR 反應(yīng)擴增出很高的拷貝數(shù)，下一步檢測就成了關(guān)鍵。熒光素（溴化乙錠，EB）染色凝膠電泳是最常用的檢測手段。電泳法檢測特異性不太高，引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判，但因為其簡捷易行，成為了主流檢測方法。
應(yīng)用
PCR 是一種用于放大擴增特定的 DNA 片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊 DNA 復(fù)制，最大特點是能將微量的 DNA 大幅增加。因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發(fā)、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的 DNA，就能用 PCR 加以放大，進(jìn)行比對。這也是「微量證據(jù)」的威力之所在。
實時熒光定量 PCR（Quantitative Real-time PCR,qPCR）
基本原理
qPCR 技術(shù)是在反應(yīng)體系中加入熒光報告基團和熒光淬滅基團，隨著 PCR 反應(yīng)的進(jìn)行，擴增產(chǎn)物不斷積累，導(dǎo)致熒光信號不斷積累， 從而利用熒光信號的變化實時監(jiān)測整個 PCR 進(jìn)程。
根據(jù) PCR 定量原理公式可推導(dǎo)出， 模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)與閾值循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，模板起始拷貝數(shù)越多，熒光信號達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)越少，即 Ct 值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)熒光基團發(fā)出的熒光強度與 PCR 擴增產(chǎn)物的數(shù)量呈對應(yīng)關(guān)系， 只要對熒光信號進(jìn)行實時監(jiān)測并得到未知樣品的 Ct 值，即可通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算未知樣品的起始拷貝數(shù)。
Ct 值指 PCR 擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)數(shù)。相同模板進(jìn)行 96 次擴增，終點處產(chǎn)物量不恒定，但 Ct 值卻極具重現(xiàn)性。
模板 DNA 量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少，即 Ct 值越小。Log 起始模板濃度與 Ct 呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品 Ct 值，就可以計算出樣品中所含的模板量。
目前常用熒光標(biāo)記方法
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方法 |
優(yōu)點 |
缺點 |
應(yīng)用范圍 |
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SYBR Green I |
適用性廣 靈敏 方便 便宜 |
引物要求高 易出現(xiàn)非特異條帶 |
科研中對各種目的基因定量分析，基因表達(dá)量的研究，轉(zhuǎn)基因重組動植物研究 |
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Taqman |
特異性高 重復(fù)性好 |
價格高 只適合特定目標(biāo) |
病原體檢測，疾病耐藥基因研究，藥物療效考核，遺傳疾病診斷 |
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分子信標(biāo) |
高特異性 熒光背景低 |
只適合特定目標(biāo) 設(shè)計困難 價格高 |
特定基因分析，SNP分析 |
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熒光定量 PCR 反應(yīng)體系舉例 |
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試劑 |
含量 |
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2xGoTaq Master Mix |
5µl |
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無核酸酶水 |
3.5µl |
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上游引物 |
0.25µl |
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下游引物 |
0.25µl |
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基因組 DNA |
1µl（約20ng）梯度稀釋 |
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共 10µl |
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儀器與耗材
在普通 PCR 儀的基礎(chǔ)上增加一個熒光信號采集系統(tǒng)和計算機分析處理系統(tǒng)，就成了熒光定量 PCR 儀。其 PCR 擴增原理和普通 PCR 儀擴增原理相同，只是 PCR 擴增時加入的引物是利用同位素、熒光素等進(jìn)行標(biāo)記，使用引物和熒光探針同時與模板特異性結(jié)合擴增。擴增的結(jié)果通過熒光信號采集系統(tǒng)實時采集信號連接輸送到計算機分析處理系統(tǒng)得出量化的實時結(jié)果輸出，把這 PCR 儀叫做實時熒光定量 PCR 儀 (qPCR 儀)。熒光定量 PCR 儀有單通道，雙通道，和多通道。當(dāng)只用一種熒光探針標(biāo)記的時候，選用單通道，有多熒光標(biāo)記的時候用多通道。單通道也可以檢測多熒光的標(biāo)記的目的基因表達(dá)產(chǎn)物，因為一次只能檢測一種目的基因的擴增量，需多次擴增才能檢測完不同的目的基因片段的量。該儀器主要用于醫(yī)學(xué)臨床檢測，生物醫(yī)藥研發(fā)，食品行業(yè)，科研院校等機構(gòu)。
實時熒光定量 PCR 與普通 PCR 對比
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實時熒光定量 PCR |
普通 PCR |
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檢測 |
熒光檢測 |
電泳跑膠 |
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特異性 |
引物和熒光探針，特異性高 |
引物，特異性低 |
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靈敏度 |
熒光檢測靈敏度高 |
電泳檢測相對較低 |
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自動化程度 |
無需跑膠，自動化程度高 |
結(jié)束后再跑膠 |
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結(jié)果 |
全程監(jiān)控，準(zhǔn)確的算法進(jìn)行定量 |
定性 |
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污染 |
封閉體系，環(huán)境污染少 |
污染可能性大 |
應(yīng)用
定性分析研究：雜合或純合子鑒定，SNP 分析等。
絕對定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷貝數(shù)定量分析，GMO 定量檢測等。
相對定量研究：mRNA 表達(dá)分析，siRNA 效果確認(rèn)，差異顯示結(jié)果驗證等。
1992 年，Sykes 等從非淋巴細(xì)胞和正常體細(xì)胞背景中鑒定突變的白血病細(xì)胞，檢測了復(fù)雜背景下低豐度的 IgH 重鏈突變基因。該研究中提出了三個重要的原則：有限稀釋、終點信號的有或無及對數(shù)據(jù)泊松分布的統(tǒng)計處理，為以后 dPCR 的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)，逐步拉開了 Digital PCR 研究和應(yīng)用的序幕......
三朵金花，先表兩朵，數(shù)字 PCR（Digital PCR,dPCR）下期綻放！
參考文獻(xiàn)：
- 王玉倩,薛秀花.實時熒光定量PCR技術(shù)研究進(jìn)展及其應(yīng)用[J].生物學(xué)通報，2016, 51(2).
- 馮彩寧,熒光定量PCR實驗原理及數(shù)據(jù)分析，生工生物工程（上海）有限公司.
- 張志坤,實時熒光定量PCR的原理、操作及其應(yīng)用,河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)研究中心.
- PCR技術(shù)發(fā)展和應(yīng)用,百度文庫.
