食品微生物快速檢測技術研究動態(tài)-中國微生物菌種查詢網
       食物病原微生物是食品安全的重要內容，而對其的快速檢測（驗）一直是相關研究的熱點。近年來，微生物的快速檢測和自動化研究進展迅速。依靠培養(yǎng)基進行培養(yǎng)、分離及生化鑒定的傳統(tǒng)方法費時費力�？焖贆z測及其自動化則綜合引用微生物學、化學、分子生物學、生物物理學、免疫學以及血清學試驗技術對微生物進行分離、檢測、鑒定和計數。和傳統(tǒng)方法比較，更快、更方便、更靈敏。因此，在醫(yī)學、食品、農業(yè)、工業(yè)和環(huán)境等方面得到了廣泛了應用下面介紹幾種食品微生物快速檢測技術。

1. 氣相色譜法
其原理是將微生物細胞經過水解、甲醇分解、提取以及硅烷化、甲基化等衍生化處理后，使之分離盡可能多的化學組分供氣相色譜儀進行分析。不同的微生物所得到的色譜圖中，通常大多數的峰是共性的，只有少數的峰具有特征性，可被用來進行微生物鑒定。分析檢測各種常見細菌、酵母菌、霉菌等。

2.“既用膠”測定法
把1ml食物樣品傾入一盛有無菌液體培養(yǎng)基的試管中，混勻后再將混合物倒入一個裝有膠質的特殊培養(yǎng)皿中�；旌衔锱c膠質接觸后便形成瓊脂相似的復合物。經培養(yǎng)后便可計數菌種及數量。
該系統(tǒng)是包裝好的產品，用時不需滅菌，極適合野外測定。目前，這種系統(tǒng)正在受到美國AOAC的鑒定。

3. 以生物化學手段建立的快速檢測技術
3.1微生物專有酶快速反應系統(tǒng)的檢測技術
微生物專有酶快速反應是根據細菌在其生長繁殖過程中可合成和釋放某些特異性的酶，按酶的特性，選用相應的底物和指示劑，將他們配制在相關的培養(yǎng)基中。根據細菌反應后出現的明顯的顏色變化，確定待分離的可疑菌株，反應的測定結果有助于細菌的快速診斷。這種技術將傳統(tǒng)的細菌分離與生化反應有機地結合起來，并使得檢測結果直觀，正成為今后微生物檢測發(fā)展的一個主要發(fā)展方向。
3.2常規(guī)的致病微生物檢測技術
不同病原體的化學組成或所產生的代謝產物各異，利用微生物（主要是細菌）的不同生化和生理特性，可以對細菌進行鑒定。生化鑒定是檢測細菌最常用的方法。細菌檢驗中的微量化和自動化，是微生物學診斷中的發(fā)展方向，經過多年的研究和不斷改進，常規(guī)的臨床細菌學診斷己由系列的試劑盒商品成套供應，來替代各檢驗部門自行配制試劑、手工操作的緩慢和繁瑣工作。
另外，氣相色譜和高效液相色譜的分析也應用到致病微生物的檢測中，主要是依據不同病原體的化學組成或所產生的代謝產物各異，利用上述色譜檢查可直接分析各種體液中的細菌代謝產物、細胞中的脂肪酸、蛋白、氨基酸、多肽、多糖等，以確定病原微生物的特異性化學標志成分，協(xié)助病原診斷和檢測，其中以氣相色譜應用較多，該法簡單、快速。

4. 以免疫學方法建立的快速檢測技術
免疫檢測的基本原理是抗原抗體反應�？乖�抗體反應是指抗原與相應抗體之間所發(fā)生的特異性結合反應。不同的微生物有其特異的抗原，并能激發(fā)機體產生相應的特異性抗體。在免疫檢測中，可利用單克隆抗體檢測微生物的特異抗原，也可利用微生物抗原檢測體內產生的特異抗體，兩種方法均能判斷機體的感染狀況。
4.1免疫熒光技術
免疫熒光技術（immunofluorescenceTechnique）是用熒光素標記的抗體檢測抗原或抗體的免疫學標記技術，又稱熒光抗體技術。所用的熒光素標記抗體通稱為熒光抗體，免疫熒光技術在實際應用上主要有直接法和間接法。直接法是在檢測樣品上直接滴加己知特異性熒光標記的抗血清，經洗滌后在熒光顯微鏡下觀察結果。間接法是在檢樣上滴加己知的細菌特異性抗體，待作用后經洗滌，再加入熒光標記的第二抗體。如研制成的抗沙門氏菌熒光抗體，用于 750 例食品樣品的檢測，結果表明與常規(guī)培養(yǎng)法符合率基本一致。免疫熒光直接法可清楚地觀察抗原并用于定位標記觀察。
4.2酶免疫測定技術
酶免疫測定（enzymeimmunoassay, EIA）根據抗原抗體反應是否需要分離結合的和游離的酶標記物而分為均相和非均相兩種類型。非均相法較常用，包括液相免疫測定法與固相免疫測定法。固相免疫測定法的代表技術是ELISA。ELISA技術是抗原或抗體吸附到固相載體上作為一種試劑來檢測標本中抗體或抗原的一種方法。根據反應原理，加入某種酶標記的抗體或抗原，洗滌除去未結合物，加入該酶的底物，酶催化底物生成有色產物，產物的量與標本中受檢物的量有關，根據反應顏色的深淺可定量測定。
EIA 在微生物學領域中可用于病原的檢測、抗體檢測和細菌代謝產物的檢測。EIA具有高度的特異性和敏感性，幾乎所有可溶性的抗體抗原反應系統(tǒng)均可檢測。與放射免疫方法相比較，EIA的標記試劑較穩(wěn)定，且無放射性危害；與免疫熒光技術相比，EIA敏感性高，不需特殊設備，結果觀察簡便。
 4.3免疫印跡技術
免疫印跡（immunoblot）法分三個步驟：第一，SDS聚丙烯酞胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。將蛋白質抗原按分子大小和所帶電荷的不同分成不同的區(qū)帶。第二，電轉移。目的是將凝膠中己分離的條帶轉移至硝酸纖維素膜上。第三，酶免疫定位，該步的意義是將前兩步中己分離，但肉眼不能見到的抗原帶顯示出來。將印有蛋白抗原條帶的硝酸纖維素膜依次與特異性抗體和酶標記的第二抗體反應后，再與能形成不溶性顯色物的酶反應底物作用，最終使區(qū)帶染色。本法綜合了SDS-PAGE的高分辨率及ELISA的高敏感性和高特異性，是一種有效的分析手段。
4.4免疫組織化學方法
是應用免疫學中的抗原抗體反應，借助可見的標記物，在組織原位顯示抗原或抗體的方法。常用的免疫組織化學方法有熒光免疫和酶免疫組化技術、金標免疫組織化學技術和免疫電鏡，該技術特點是對細胞涂片、印片、組織切片進行處理和染色鏡檢。免疫組化技術彌補了上述血清學診斷方法的不足，使得在細胞或組織內檢測病原微生物成分成為可能。對于在宿主組織液中微量表達或不表達抗原、抗體的微生物，免疫組化具有較好的輔助診斷價值。利用免疫組化技術，還能觀察被侵犯組織致病微生物繁殖和對組織破壞情況。
 
5. 估計微生物數量和菌量的新方法
通過微生物生長所引起的物理、生物化學、生物物理指標的變化來對樣品中的微生物量進行估計，其中有ATP水平、阻抗和導電、接觸酶的測定等。
化學發(fā)光的原理：利用可發(fā)光化學物質測定被分析物質的濃度。所有生物體的磷酸核苷酸（ATP）含量是相對固定的，當螢火蟲酶系統(tǒng)和ATP接觸時，發(fā)生光生物學反應，就會發(fā)光。在熒光素和熒光酶過量時，熒光強度與ATP(含量成正比關系。用ATP生物發(fā)光確定細菌總數的準確程度依賴于從食品樣品中細菌分離的效果和實驗前將樣品本身的ATP消除的程度。
阻抗測定的原理：當細菌生長時，將大分子物質降解成小的帶高電荷的粒子，從而改變周圍培養(yǎng)基的導電性能。通過測定阻抗或電導變化，可以了解生物活動情況。當微生物含量達到某一值時，阻抗的變化與微生物含量呈相關性，即與污染程度呈相關性。
微熱量計法（Microcalorimetry）：利用細菌生長而產生熱量的原理設計而成。微生物在生長過程中產生熱量，雖然產生的量很小，但仍能通過敏感的微熱量計進行測量。用微熱量計對微生物計數時，溫譜圖必須與絕對微生物細胞數呈相關性，一旦建立了參考溫譜圖，食品樣品溫譜圖便可與之相比較而得到微生物的絕對數量。
放射測量法（Radiometric）：利用細菌代謝碳水化合物而產生CO2的原理，把微量的放射性標記引入葡萄糖或其他糖類分子中，細菌生長時，糖被利用并放出含放射標記的CO2。有一種儀器（Bactec）可用來測定放射性CO2，放射量與菌數成正比。這一方法適用于測定食品中的細菌.
接觸酶實驗：利用接觸酶反應來估計食品中微生物含量。由這一原理設計出的儀器稱為接觸酶測定儀（Catakasneter）。其原理是通過計算一個含有接觸酶的紙盤，在盛有H2O2的試管中的漂浮時間來估計菌數。當樣品中接觸酶含量高時（表明接觸酶陽性細菌含量高），紙盤上浮的時間短（以 s計）；反之，接觸酶的濃度低，紙盤上浮的時間長（以100s~1000s計）。

6. 分子生物學方法
DNA探針（Gene-Trak）。DNA探針共有兩種類型：一種是含有放射性標記的探針；另一種是無放射性標記的探針。放射性標記的核酸探針的特異性非常強，檢測病原微生物速度比常規(guī)法快得多。非放射性標記的核酸探針類型很多，應用較廣泛的有用生物素 - 抗生物素蛋白系統(tǒng)標記的非放射性核酸探針。生物素 - 抗生物素蛋白系統(tǒng)標記的探針已在沙門氏菌、產腸毒素大腸桿菌及乙型肝炎病毒檢測中得到了應用。
PCR(PolymeraseChaninReaction)是聚合酶鏈式反應的簡稱。利用PCR檢測食品中的致病菌，可以對那些人工難以培養(yǎng)的微生物進行檢測。由于在所有細菌中編碼,rRNA的一些基因保守性很強，因此可用 (PCR擴增其相應的DNA片斷，來快速、靈敏地檢測樣品中是否存在某些細菌或致病菌，尤其是那些人工無法培養(yǎng)的微生物。最近又設計了一種DNA指紋圖譜自動分析系統(tǒng)——Ribo Printer (Dupont de Nemours公司產品）。具體操作是從細菌細胞中提取DNA，接著用限制性酶將DNA降解成片段，DNA片段通過電泳得到分開，再轉移至雜交膜上與 DNA探針雜交。由于引入了化學發(fā)光標記物，雜交片段發(fā)出的光線被相機捕獲，得到的核酸圖譜與其他貯存的DNA核酸堿基序列進行比較，通過核酸匹配分析可以對微生物進行鑒定。

7. 活細胞計數檢測
自動旋轉平板和激光菌落掃描計數法，在均勻薄層瓊脂營養(yǎng)基表面，以阿基米德螺旋線方式將液體樣品從中心到邊緣均勻涂在平板上。經過培養(yǎng)在計數格區(qū)間內計數，或用激光計數器來掃描平板，以透過光的強度來檢測菌落的存在。Petrifium系統(tǒng)(3MCoSt.Paul, Minn)用可重新水化的營養(yǎng)成分取代瓊脂傾注平板。把這種營養(yǎng)成分和一種膠態(tài)試劑一起嵌入在一系列薄膜上。取1mL液體樣品滴于膜系統(tǒng)中央，重新水化的培養(yǎng)基便可作為微生物生長的支持物，經過培養(yǎng)后，便可像常規(guī)平皿計數一樣直接在膜系統(tǒng)上對菌落進行計數。Petrifilm2000系列從菌群鑒定到結束只需培養(yǎng)8h。
Redigel系統(tǒng)（RCR Scientific）由多種營養(yǎng)成分與果膠混合并裝入試管，混勻后無需溶解凝膠。試樣直接加入試管后倒入覆蓋有一層鈣質的培養(yǎng)皿中，倒入液體與鈣質形成果膠鈣。培養(yǎng)后進行菌落計數。
疏水網膜（HGMF）技術是常規(guī)平皿劃線方法的改進。樣品用疏水網膜過濾，要檢測的微生物被捕獲在疏水網膜的小格中。在接種后的疏水網膜上傾入適當的瓊脂，在適當時間培養(yǎng)后即可計數。由于菌落都是正方形，人工或機械計數都很方便�？捎糜诮湍负兔咕�計數、沙門氏菌檢測、大腸桿菌/大腸菌群檢測。