LaVision 光片照明顯微鏡在淋巴管畸形研究中的應(yīng)用
  LaVision BioTec Light-Sheet Microscopy光片照明顯微鏡
文獻(xiàn)簡述——VIPAR, a quantitative approach to 3D histopathology applied to lymphatic malformations
背景：
在對淋巴水腫和其他淋巴疾病進(jìn)行藥物開發(fā)和外科治療過程中，對其機(jī)理、機(jī)制進(jìn)行程序化機(jī)械化的認(rèn)識理解尤其重要，然而，缺乏有效的研究診斷工具已經(jīng)大大限制了這一進(jìn)程。而且，在淋巴管真正的病理改變研究中，標(biāo)準(zhǔn)的二維組織切片法無法獲得想要的結(jié)果。
方法：
三維重建和數(shù)據(jù)提取的體量信息組織病理學(xué)分析（VIPAR）是一種基于光片熒光顯微鏡分析組織樣本的方法，通過顯微圖像庫的數(shù)字重建和可視化而實現(xiàn)。使用VIPAR可以對脈管進(jìn)行半自動分割，并隨后對特征血管形狀和連接參數(shù)進(jìn)行無偏提取。在這項研究中，我們使用VIPAR分析健康淋巴組織和淋巴管瘤皮膚樣本。
結(jié)果：
數(shù)字三維重建直觀的，全面的展示了組織中的淋巴管和血管�；诖隧椉夹g(shù)發(fā)現(xiàn)的最為明顯的特征是淋巴水腫皮膚中雜亂的淋巴管排布和淋巴管瘤皮膚的增生(4.36倍淋巴管體積增加)。兩種異常均由基于提取的血管形態(tài)和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)進(jìn)行的連接分析而發(fā)現(xiàn)。對獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行定量評估，發(fā)現(xiàn)淋巴水腫皮膚中淋巴管長度明顯減少，淋巴管瘤皮膚中淋巴管平直度顯著降低，而淋巴管瘤中的血管長度顯著增加。
LaVision光片顯微鏡的詳細(xì)介紹：http://qd-china.com/products2.aspx?id=434
結(jié)果圖像示例：
VIPAR是在光片成像和可視化的基礎(chǔ)上，加上分割、骨架化和特征提取三個3D組織重建的基本步驟的研究分析方法。我們將其用于皮膚中微血管的可視化、三維重建和定量分析。VIPAR對血管床的分析基于半自動化血管分割，以完全無偏的方式提取特征血管參數(shù)。下圖為樣品準(zhǔn)備、成像和VIPAR方法分析的過程示意圖。  結(jié)果圖一，用光片顯微鏡觀察人真皮血管和淋巴管的空間排列
三維可視化結(jié)果顯示，在真皮的乳頭層（圖1C，紅色箭頭）和網(wǎng)狀層（圖1C，綠色箭頭）可見明顯的淋巴叢。兩種淋巴叢都是由不連續(xù)分布的血管束連接的，這些血管束通常伴隨著淋巴管（圖1A）。通過皮膚觀察乳頭叢的正面，我們立即發(fā)現(xiàn)了盲端毛細(xì)淋巴管(用星號表示，B, F，和H圖1)和有致密的表達(dá)PROX1的淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的區(qū)域(在B,F和H中用白色箭頭標(biāo)出(圖1))。這樣的致密結(jié)構(gòu)(圖1中,G和H)在淋巴管分叉附近頻繁出現(xiàn)，是它們代表淋巴管瓣的假設(shè)的額外證據(jù)。  結(jié)果圖二 使用光片顯微鏡對健康和患病皮膚樣本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了在傳統(tǒng)切片方法上無法識別的淋巴管缺陷。
我們通過對健康個體(圖1和圖2、D、G、J)、淋巴水腫個體(圖2、E、H和K) 以及淋巴管瘤個體(圖2、F、I和L)的相同染色的腿部皮膚進(jìn)行VIPAR分析以比較傳統(tǒng)組織病理學(xué)和VIPAR的效果。VIPAR的3D重建過程立即顯示淋巴管增生現(xiàn)象(對比圖2,D和G，圖2,E和H，圖2,F和I)，與組織病理學(xué)分析(圖2,A-C)一致。  圖三 VIPAR方法可以檢測出健康皮膚和病理皮膚標(biāo)本中淋巴管的特征差異。
PDPN陽性淋巴管的3D重建顯示了健康皮膚與及淋巴水腫和淋巴管瘤皮膚的明顯差異（圖3A-3C)。對淋巴管進(jìn)行分割后的三維可視化顯示，淋巴管密度、體積和形態(tài)的差異得到了保留。淋巴水腫中不規(guī)則排列的淋巴管片段的特征和淋巴管瘤的增生在分割完成的淋巴管中很容易辨認(rèn)（圖3D-3I）。為了定量評估病理樣本的變化，我們使用基于分割生成的二值圖像提取的骨架（圖3J-3L）計算拓?fù)涮卣�，包括淋巴管的分支點及其連通性（圖3M-3O)。  圖四：實驗組和対照組的血管在數(shù)字三維重建中的的自動分割。
基于ESAM1免疫染色(圖5,A-C)進(jìn)行血管系統(tǒng)的評估：通過計算多個高斯尺度上的特征，對血管進(jìn)行半自動分割，然后手動全局閾值化，得到二值圖像，再進(jìn)行后處理，去除小的分割錯誤。分割后的血管結(jié)構(gòu)表示為二元體(圖5,D-F)。而在隨后的骨架化過程中，每條血管內(nèi)的中軸線均采用立體減薄法計算得出(圖5,G-I)。  結(jié)論：
綜上，VIPAR被證明適用于分析人類皮膚樣品中的兩種脈管系統(tǒng)。它可以檢測出明顯的缺陷，并以無偏差的數(shù)據(jù)提取和形態(tài)參數(shù)計算定量評估淋巴水腫和淋巴管瘤的病理狀態(tài)。 我們Quantum量子科學(xué)儀器貿(mào)易（北京）有限公司，作為LaVision BioTec GmbH在中國區(qū)域的合作伙伴，我們將持續(xù)為廣大科研用戶提供最新的產(chǎn)品應(yīng)用案例和技術(shù)前沿信息。
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