一種新型可視細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)方法及系統(tǒng)搭建的介紹
廣州科適特科學(xué)儀器有限公司

一.細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)原理
定義：趨化性（Chemotaxis，亦被稱為化學(xué)趨向性）是趨向性的一種，指身體細(xì)胞、細(xì)菌及其他單細(xì)胞、多細(xì)胞生物依據(jù)環(huán)境中某些化學(xué)物質(zhì)而趨向的運(yùn)動。這對細(xì)菌尋找食物(如葡萄糖)十分重要，細(xì)菌以此趨進(jìn)有較高食物分子濃度的地方，或遠(yuǎn)離有毒(如苯酚)的地方。在多細(xì)胞生物中，趨化性對其發(fā)展和其他正常功能一樣不可或缺。正趨化性指趨向較高化學(xué)物質(zhì)濃度的運(yùn)動，而負(fù)趨化性則相反。

二.目前細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)方法的主要問題
目前一般做這個(gè)實(shí)驗(yàn)的方法：用transwell做，如下圖，下部空間放誘導(dǎo)劑，上部空間放細(xì)胞，經(jīng)過一定時(shí)間，數(shù)細(xì)胞穿到下部空間的數(shù)量（細(xì)胞染色或者把細(xì)胞擦下來再數(shù)），穿到下部的細(xì)胞越多，說明趨向性越強(qiáng)，進(jìn)而得出細(xì)胞的趨化性結(jié)果。

主要問題：

（1）由于顯微鏡工作距離的限制，無法使用顯微鏡進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察，無法記錄細(xì)胞趨化過程，如果能夠?qū)崟r(shí)拍攝記錄細(xì)胞趨化的過程，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更直觀。
（2）采用末端點(diǎn)測量方式，transwell只能數(shù)最終穿到下室的細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞運(yùn)動速度是沒辦法考察的。
（3）不穩(wěn)定的濃度梯度，transwell要做一系列的孔才能完成濃度梯度的趨化實(shí)驗(yàn)，因?yàn)閠ranswell每孔只能在下室放一個(gè)定值的濃度，所以要做出一系列濃度梯度，就要做好幾孔（比如每孔分別設(shè)置2，4，6，8單位濃度，這2，4，6，8就是個(gè)梯度）；這個(gè)實(shí)驗(yàn)做濃度梯度的目的是看細(xì)胞是不是確實(shí)在誘導(dǎo)劑越濃的情況下有更強(qiáng)或更弱的趨向性（或根據(jù)誘導(dǎo)劑濃度的升高有個(gè)趨向性的高低變化）。
（4）非生理實(shí)驗(yàn)環(huán)境，生理狀態(tài)下需要控制溫度，濕度，CO2濃度，O2濃度，流體環(huán)境的。

三．可視化細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)工作原理和流程

基本原理：在兩個(gè)大的蓄液池中通過一個(gè)大概60ul的狹窄觀察區(qū)域相連，細(xì)胞注入通道內(nèi)的基質(zhì)膠中，在其上方形成線性和時(shí)間穩(wěn)定的濃度梯度， 線性濃度梯度(維持48小時(shí)以上)。

主要工作流程

1.細(xì)胞接種進(jìn)行細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)測試
2.采用KOSTERMAS顯微圖像分析軟件，TIME-LASPE進(jìn)行活細(xì)胞連續(xù)錄像拍照（每批次間隔10分鐘）
3.細(xì)胞軌跡追蹤（手動或者自動），使用ImageJ軟件，下載細(xì)胞趨化和遷移Plugin
4.數(shù)據(jù)分析及評估，使用ImageJ軟件，下載細(xì)胞趨化和遷移Plugin

四．可視化細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)工作解決方案和系統(tǒng)搭建

系統(tǒng)組成包含：（1）KOSTER IMC-800T倒置相差顯微鏡（2）KOSTERCAM 500萬像素高分辨率攝像頭及KOSTERMAS顯微圖像處理軟件（3）KOSTER & IBIDI顯微鏡活細(xì)胞培養(yǎng)裝置 （4）細(xì)胞趨化通道載玻片（5）ImageJ軟件，細(xì)胞趨化和遷移Plugin。

五．可視化細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)優(yōu)勢

（1）系統(tǒng)采用的通道載玻片具有超薄底部及高質(zhì)量光學(xué)性能，合適高端顯微鏡及獲得優(yōu)質(zhì)的成像效果。
（2）能實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞趨化情況，計(jì)算每個(gè)細(xì)胞的趨化速率（通過后期實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，根據(jù)細(xì)胞的運(yùn)動   軌跡和時(shí)間算出運(yùn)動速率），用transwell是做不到這點(diǎn)的（因?yàn)閠ranswell只能數(shù)最終穿到下室的細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞運(yùn)動速度是沒辦法考察的）；
（3）系統(tǒng)專門配置的通道載玻片適配器可提供加熱，完整匹配顯微鏡系統(tǒng)，適合各種工作距離物鏡。
（4）這個(gè)系統(tǒng)做出的濃度梯度可以維持48小時(shí)，對快速遷移細(xì)胞和慢遷移細(xì)胞都適用；也就是說即使細(xì)胞運(yùn)動很慢，也不用擔(dān)心濃度梯度會因?yàn)榉胖脮r(shí)間稍長就消失了；
（5）除了做濃度梯度的細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)，還可以做不同誘導(dǎo)劑的細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)，觀察細(xì)胞在不同誘導(dǎo)劑之間的選擇，就是說，可以在兩側(cè)的三角形腔室放不同的誘導(dǎo)劑；
（6）這個(gè)產(chǎn)品還有配套的圖像分析，錄下完整的視頻，就能把數(shù)據(jù)整理出來，數(shù)據(jù)包括了目標(biāo)細(xì)胞的所有運(yùn)動軌跡，速率等，7-10個(gè)工作日出結(jié)果；
（7）可進(jìn)行2D和3D的細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)

六．部分參考文獻(xiàn)

1.The drebrin/EB3 pathway drives invasive activity in prostate cancer. Oncogene (2017) 36, 411  –4123,AE Dart1,
DC Worth1, G Muir2, A Chandra3, JD Morris4, C McKee5, C Verrill6, RJ Bryant6 and PR Gordon-Weeks

2.A RAB35-p85/PI3K axis controls oscillatory apical protrusions required for efficient chemotactic migration . NATURE
COMMUNICATIONS | (2018) 9:1475 Salvatore Corallino1, Chiara Malinverno1, Beate Neumann2, Christian Tischer2, Andrea Palamidessi1,Emanuela Frittoli1, Magdalini Panagiotakopoulou3, Andrea Disanza1, Gema Malet-Engra1, Paulina Nastaly1,Camilla Galli1, Chiara Luise4, Giovanni Bertalot4, Salvatore Pece4, Pier Paolo Di Fiore 1,4,5, Nils Gauthier1,Aldo Ferrari3, Paolo Maiuri 1 & Giorgio Scita 1,5