dPCR和qPCR(Real-time PCR)技術(shù)定量檢測DNA/RNA時抑制劑的影響對比

眾所周知，數(shù)以千種的化學(xué)物質(zhì)會抑制PCR反應(yīng)有作用，而生物樣本往往都會含有類似的化合物，在DNA/RNA純化時，這類化合物很難去除，所以會存在DNA/RNA樣本中。

> qPCR和Crystal dPCR進(jìn)行DNA/RNA定量的比較

qPCR (Real-time PCR)進(jìn)行DNA/RNA定量時，基于Ct值，且依賴于分析的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過未知樣品與含有已知量核酸標(biāo)準(zhǔn)品之間的Ct值得到未知樣品的濃度。但當(dāng)樣品中存在抑制劑時，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品之間由于背景不同，所以PCR反應(yīng)效率可能不同，因此定量結(jié)果將會有偏差（圖1A）。

Naica crystal dPCR進(jìn)行DNA/RNA定量時，結(jié)果判讀在于通過熒光值區(qū)分微滴的陽性或陰性。即使有因抑制劑存在而導(dǎo)致PCR反應(yīng)效率降低，仍然可以實現(xiàn)準(zhǔn)確定量（圖1B）。

圖1.腐殖酸在qPCR（A）和Crystal dPCR（B）系統(tǒng)分析中的影響比較

在qPCR和Crystal dPCR平臺檢測中PCR反應(yīng)均包含1X PerfeCta Multiplex qPCR Tough-mix，100 nM熒光素，500 nM ALB基因正向和反向引物，250 nM Cy5標(biāo)記TaqMan探針和5.4 ng / uL人類基因組DNA。分別摻入0, 50和100ug / mL的腐殖酸。

還有很重要的一點我們需要注意，抑制劑對于同一DNA/RNA樣品中不同靶標(biāo)基因絕對定量的影響也可能不同（圖2）。Naica Crystal dPCR系統(tǒng)有3個熒光通道，檢測您感興趣的基因上不同區(qū)域或基因組上不同的靶標(biāo)基因，以檢查這種偏差。

圖2.腐殖酸的存在對于Crystal dPCR中對不同靶標(biāo)的影響檢測

多重Crystal dPCR反應(yīng)中含有PerfeCta Multiplex qPCR Toughmix，ALB基因的引物和探針（Cy-5標(biāo)記），EGFR基因的引物和探針（HEX標(biāo)記）和BRAF的引物和探針（FAM標(biāo)記），并且使用相同量的人類基因組DNA摻入不同濃度的腐殖酸（利用Sigmoid即S型函數(shù)擬合）。以不添加抑制劑的DNA定量為0％抑制，計算抑制百分比。

> qPCR和Crystal dPCR對抑制劑的耐受性比較

我們在qPCR和Crystal dPCR平臺比較了存在兩種在樣品中發(fā)現(xiàn)的已知抑制劑對DNA定量分析的影響，分別是在土壤樣本中存在的腐殖酸和在收集的血樣中用作抗凝血劑的肝素。結(jié)果顯示，與qPCR相比，Crystal dPCR在任何較高濃度抑制劑存在的情況下，仍然可以進(jìn)行準(zhǔn)確定量（圖3）。

圖3. 不同濃度的腐殖酸（A）和肝素（B）對qPCR和Crystal dPCR的抑制。

qPCR和Crystal dPCR反應(yīng)包含PerfeCta Multiplex qPCR Toughmix，相同量的人類基因組DNA，以及測試腐殖酸抑制作用的靶向BRAF基因和測試肝素抑制作用的EGRF基因的引物和探針。所有樣品進(jìn)行2次實驗，每次實驗三個重復(fù)（利用Sigmoid即S型函數(shù)擬合）。以不添加抑制劑的DNA定量為0％抑制，計算抑制百分比。

綜上所述，當(dāng)對存在抑制劑的樣品進(jìn)行DNA/RNA分析時，Crystal dPCR可以比qPCR的結(jié)果更為可靠。Crystal dPCR是您一直在尋找的針對含抑制劑樣本中核酸檢測和定量的最佳解決方案。