作者：俞曉峰 博士 賽業(yè)模式動(dòng)物高級(jí)副總裁、高級(jí)科學(xué)家 

前沿

相對(duì)于過(guò)去常用的腫瘤細(xì)胞接種和免疫缺陷小鼠模型，基因修飾小鼠（GEM）模型是建立在天然完整免疫條件下的原發(fā)（de novo）腫瘤。因此，作為腫瘤學(xué)研究的工具，GEM模型更能模擬人腫瘤的組織病理學(xué)和分子學(xué)特征，表現(xiàn)為有更好的遺傳異質(zhì)性，其優(yōu)勢(shì)在于能反映腫瘤細(xì)胞自身，以及腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞等相互作用因素，包括具有引起原發(fā)腫瘤開(kāi)始形成到發(fā)展為轉(zhuǎn)移性疾病的能力。GEM模型的建立及應(yīng)用極大促進(jìn)了腫瘤學(xué)研究領(lǐng)域的發(fā)展與進(jìn)步。目前，GEM模型已成功應(yīng)用于驗(yàn)證潛在腫瘤基因與藥物靶點(diǎn)，考核治療效果，分析腫瘤微環(huán)境影響，以及評(píng)價(jià)藥物耐藥性機(jī)制等研究領(lǐng)域。而且，結(jié)合臨床病人研究與構(gòu)建更加合理有效的GEM模型，優(yōu)化腫瘤干預(yù)的臨床前試驗(yàn)，無(wú)疑將進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤治療新策略的研發(fā)，提高其有效轉(zhuǎn)化為臨床上實(shí)際應(yīng)用的成功率。

目前腫瘤學(xué)研究面臨的主要挑戰(zhàn)

腫瘤學(xué)研究及腫瘤治療在臨床上仍然面臨著許多挑戰(zhàn)，其中抗腫瘤藥物耐受性的形成和腫瘤轉(zhuǎn)移性疾病是當(dāng)前面臨的兩個(gè)重要現(xiàn)實(shí)難題�？鼓[瘤耐藥性的產(chǎn)生是由于異質(zhì)性腫瘤中的原發(fā)突變的出現(xiàn)，或治療前耐藥克隆的大量生長(zhǎng)引起的，而現(xiàn)有靶向抗腫瘤制劑的單一療法，或化學(xué)藥物療法都無(wú)法避免藥物耐受的發(fā)生。而且，在獲得明顯成功治療之后，少量藥物耐受腫瘤細(xì)胞可以存活下來(lái)，并在一定時(shí)間后，成為主要細(xì)胞群，最終形成與原始腫瘤表型不同的復(fù)發(fā)疾病。而腫瘤轉(zhuǎn)移性疾病則是導(dǎo)致90%以上與癌癥相關(guān)死亡的原因，因?yàn)楝F(xiàn)在對(duì)于這些繼發(fā)腫瘤也多無(wú)有效的治療方法。近年來(lái)，雖然針對(duì)干預(yù)腫瘤病人免疫系統(tǒng)的腫瘤免疫療法取得了一些令人鼓舞的進(jìn)展，但該療法也只是在一些特定病例情況下有效果，而對(duì)于大多數(shù)腫瘤病人仍不具有實(shí)際臨床意義。

所謂成功的腫瘤治療往往需要多種方法的協(xié)同作用，比如手術(shù)，放射線照射，細(xì)胞毒性療法，以及免疫療法等綜合策略。為了設(shè)計(jì)出有效合理的綜合治療措施與方案，首要的基礎(chǔ)與前提是深入了解腫瘤的形成與發(fā)展，轉(zhuǎn)移，及治療應(yīng)答過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞自身及其微環(huán)境細(xì)胞間相互作用的機(jī)制，從而尋找針對(duì)不同腫瘤類(lèi)型最有效的治療方法。為了實(shí)現(xiàn)這一目的，研究者們就必須依賴(lài)于動(dòng)物模型的臨床前研究。盡管過(guò)去依賴(lài)于傳統(tǒng)臨床前小鼠模型（即通過(guò)建立移植人腫瘤細(xì)胞系或同種小鼠腫瘤細(xì)胞系模型等方法）獲得了臨床前抗癌新療法的成功驗(yàn)證，但絕大多數(shù)的這些新療法在臨床III期試驗(yàn)中卻都以失敗而告終。

總體上講，由于傳統(tǒng)體內(nèi)腫瘤小鼠模型在預(yù)測(cè)臨床新療法效果方面的表現(xiàn)不佳，因而更加凸顯出尋找具有更好預(yù)測(cè)能力及效果的改進(jìn)型臨床前體內(nèi)模型的意義與價(jià)值。最近在基因修飾技術(shù)方面的進(jìn)步與發(fā)展，使得快速研制能更有效模擬人腫瘤的GEM模型成為現(xiàn)實(shí)，GEM模型在遺傳組成，腫瘤細(xì)胞與其腫瘤微環(huán)境的相互作用，藥物反應(yīng)及耐受等方面都更接近腫瘤病人。而新一代GEM模型的出現(xiàn)，也大大促進(jìn)抗腫瘤新療法策略轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用，最終達(dá)到提高癌癥病人生存率的目的。

腫瘤學(xué)研究中常用傳統(tǒng)小鼠模型的優(yōu)勢(shì)與不足

50年前首先在裸鼠體內(nèi)移植人/鼠腫瘤細(xì)胞系而建立的小鼠腫瘤移植模型成為腫瘤研究中常用的小鼠模型，這類(lèi)移植模型可快速測(cè)試潛在腫瘤及轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，并成為臨床前的藥物試驗(yàn)主要工具。例如，通過(guò)異種移植研究有助于揭示結(jié)腸癌（CRC）對(duì)藥物（如Vemurafenib）在小鼠體內(nèi)的耐受機(jī)制，從而實(shí)現(xiàn)在臨床試驗(yàn)中對(duì)CRC病人啟動(dòng)同時(shí)針對(duì)突變BRAF（如V600E）和EGFR的靶向聯(lián)合療法，表明這類(lèi)異種移植模型在建立新的聯(lián)合治療策略方面的實(shí)際意義。

異種移植研究也有助于發(fā)現(xiàn)特定基因表達(dá)特征，研究其介導(dǎo)的器官特異性定位轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)。如應(yīng)用該種模型證實(shí)了傳播的乳腺癌細(xì)胞存在于血管附近，這為調(diào)控這些傳播的乳腺癌細(xì)胞提供了可能的對(duì)策。而且，應(yīng)用腫瘤細(xì)胞系移植的體內(nèi)模型研究，也為抗腫瘤免疫，T細(xì)胞耐受機(jī)制，腫瘤免疫逃逸途徑等提供了許多基本的認(rèn)識(shí)概念。這些發(fā)現(xiàn)都為目前進(jìn)行中的腫瘤免疫療法的突破奠定了基礎(chǔ)。

然而，由于腫瘤細(xì)胞系一開(kāi)始就含有許多突變，而且在體外長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)過(guò)程中，還會(huì)產(chǎn)生額外突變，因此，此類(lèi)接種模型難以真實(shí)反映人腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和遺傳異質(zhì)性，從而降低了該類(lèi)模型作為臨床應(yīng)用效果預(yù)測(cè)性的可靠性。另外，為了防止可能的排斥反應(yīng)，腫瘤細(xì)胞系的異種移植模型是建立在免疫缺陷小鼠基礎(chǔ)上，這也限制了其應(yīng)用于腫瘤發(fā)展中免疫系統(tǒng)以及治療應(yīng)答等領(lǐng)域的研究。

不同于細(xì)胞系移植模型，通過(guò)將新鮮人腫瘤活檢物移植至免疫缺陷小鼠構(gòu)建的病人來(lái)源的腫瘤移植（Patient-derived tumor xenografts，PDTX，或PDX）模型則具有更多優(yōu)勢(shì)，PDX小鼠模型的腫瘤保留了來(lái)自腫瘤病人的腫瘤組織分子，遺傳，組織學(xué)異質(zhì)性等特征（甚至經(jīng)過(guò)小鼠體內(nèi)的傳代幾代之后）。所以，PDX模型也成為目前個(gè)性化醫(yī)學(xué)和臨床前藥物篩選的有用工具。 

目前，PDX模型的研究已大規(guī)模應(yīng)用于潛在臨床藥物預(yù)測(cè)試驗(yàn)。有研究者通過(guò)構(gòu)建約1000個(gè)來(lái)自不同類(lèi)型突變的PDX模型，并應(yīng)用這些不同的PDX模型對(duì)不同藥物進(jìn)行小鼠體內(nèi)篩選，尋找藥物與腫瘤基因型之間的關(guān)聯(lián)性，以達(dá)到試驗(yàn)重復(fù)性和臨床可解釋性的統(tǒng)一。

不幸的是，PDX模型在研究某些類(lèi)型腫瘤方面（如雌激素受體陽(yáng)性的乳腺癌和前列腺癌）的不滿(mǎn)意效果成為了限制其應(yīng)用的主要障礙。而且，PDX模型必須建立在免疫缺陷小鼠上，這樣的小鼠缺乏由獲得性免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的天然抗腫瘤與促腫瘤活動(dòng)。

研究者們也明白，雖然PDX模型缺乏功能性的獲得性免疫系統(tǒng)，該模型仍可為臨床提供有價(jià)值的研究資料。正在進(jìn)行中的相應(yīng)改進(jìn)是通過(guò)移植人CD34陽(yáng)性造血干細(xì)胞或前體細(xì)胞的方法，重建人免疫系統(tǒng)的人源化的小鼠模型，并取得了顯著的成功。雖然來(lái)自某些特異譜系的人免疫細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的重建仍具有挑戰(zhàn)性，但通過(guò)引入人相關(guān)細(xì)胞因子，趨化因子，生長(zhǎng)因子等方式，獲得促進(jìn)人骨髓細(xì)胞在小鼠體內(nèi)發(fā)育與成熟的效果。

為了構(gòu)建優(yōu)化能夠支持人HLA限制性T細(xì)胞發(fā)育的免疫缺陷小鼠，應(yīng)用基因修飾技術(shù)建立人源化小鼠模型，將人HLA分子引入至敲除小鼠MHC類(lèi)型I和II相應(yīng)區(qū)域。人源化小鼠模型能作為免疫療法臨床前評(píng)價(jià)的有用工具，然而，當(dāng)人造血干細(xì)胞供體來(lái)源（如通過(guò)臍帶血或胎肝）有限時(shí)，其現(xiàn)實(shí)操作中的較高構(gòu)建成本也自然成為該模型實(shí)際應(yīng)用的不利因素了。

應(yīng)用不斷完善GEM模型研究原發(fā)腫瘤

上世紀(jì)70年代成功建立小鼠原核注射轉(zhuǎn)基因技術(shù)以后，1980年早期借助該方法第一次將克隆癌基因?qū)�入小鼠基因組中，成功制備了所謂的致癌小鼠（Oncomice）。 該致癌小鼠是應(yīng)用乳腺特異性起動(dòng)子（MMTV）特異性表達(dá)癌基因v-HRas的第一個(gè)腫瘤GEM模型，該致癌小鼠首次構(gòu)建成功，證實(shí)了該小鼠形成原發(fā)乳腺腫瘤，并極大地振奮了腫瘤研究領(lǐng)域團(tuán)體，因?yàn)榇搜芯拷Y(jié)果第一次真正證明了癌基因在正常細(xì)胞中表達(dá)能產(chǎn)生腫瘤的假說(shuō)。1992年伴隨著小鼠胚胎干細(xì)胞（ES）基因打靶技術(shù)的突破發(fā)展，成功構(gòu)建的腫瘤抑制基因（TSG）敲除小鼠，也證明了該類(lèi)TSG基因在腫瘤發(fā)生過(guò)程中的重要作用。

雖然致癌小鼠和TSG敲除小鼠提供了非常有價(jià)值的理論依據(jù)，但這兩種模型也存在其局限性。由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得的小鼠是使轉(zhuǎn)入的外源基因表達(dá)在特定組織中所有的細(xì)胞，TSG敲除小鼠則是滅活體內(nèi)所有細(xì)胞中的相關(guān)基因。然而，現(xiàn)實(shí)腫瘤的形成過(guò)程是在個(gè)體中整個(gè)組織器官健康的前提下，由于某個(gè)單細(xì)胞中某種遺傳變異的積累而導(dǎo)致的彌散腫瘤現(xiàn)象。為了符合腫瘤形成過(guò)程的實(shí)際情況，更有必要設(shè)計(jì)與構(gòu)建更加合理或復(fù)雜的小鼠模型，比如能實(shí)現(xiàn)條件性的在體細(xì)胞滅活腫瘤抑制基因，或者激活（突變）致癌基因的所謂條件性GEM模型。條件性GEM模型構(gòu)建的基本原理是將需要修飾基因兩端分別加上loxP重組位點(diǎn)，在特定Cre重組酶存在的情況下，loxP兩端之間的DNA就可被敲除，達(dá)到特定條件下滅活該基因的目的。應(yīng)用這種模型的第一個(gè)成功的例子是應(yīng)用Cre-loxP系統(tǒng)介導(dǎo)的體細(xì)胞滅活A(yù)pc基因而構(gòu)建的小鼠結(jié)直腸癌模型。應(yīng)用腺病毒載體實(shí)現(xiàn)Cre重組酶特異性表達(dá)于腸上皮細(xì)胞，組織特異性敲除APC基因，引起小鼠快速形成散在結(jié)直腸腺瘤，其特征與家族性結(jié)腸腺瘤性息肉�。‵AP）病人有許多相似性。所以，通過(guò)發(fā)現(xiàn)特異性相關(guān)癌癥基因的突變體，研究者們可構(gòu)建在組織學(xué)、分子學(xué)以及臨床上更能模擬腫瘤病人的相似特征的小鼠模型。

借助Cre-ERT融合蛋白誘導(dǎo)系統(tǒng)，研究者們可對(duì)體細(xì)胞中相關(guān)靶基因在特定時(shí)間與特定組織實(shí)施修飾，即將雌激素受體的突變激素結(jié)合區(qū)域與Cre重組酶融合在一起，建立可誘導(dǎo)調(diào)控的Cre重組酶表達(dá)系統(tǒng)，當(dāng)在雌激素類(lèi)似物（如Tamoxifen）存在的情況下，引起Cre重組酶活性在翻譯后激活，發(fā)揮其識(shí)別loxP位點(diǎn)的作用，實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)性切割靶基因的目的。因此，LoxP小鼠（即靶基因DNA兩端分別含loxP位點(diǎn)）的條件性基因修飾，通過(guò)在選擇的時(shí)間里加入誘導(dǎo)劑Tamoxifen后，控制Cre-ERT的特異性表達(dá)，達(dá)到對(duì)靶基因進(jìn)行時(shí)空與區(qū)域上特定修飾的目的。

雖然Cre-loxP系統(tǒng)能用于多于一個(gè)基因的修飾，但因這種過(guò)程是同時(shí)發(fā)生的，所以難以完全模擬腫瘤多步驟形成過(guò)程中，突變是逐漸積累形成過(guò)程的特征。最近，研究者們利用可獨(dú)立發(fā)揮作用的可誘導(dǎo)雙重組酶系統(tǒng)（如Flp-FRT/Cre-loxP，或Cre-loxP/Dre-rox），建立了對(duì)靶基因表達(dá)實(shí)施先后調(diào)控的修飾方式。該技術(shù)方法成功應(yīng)用的實(shí)際意義有如下幾方面，1. 獨(dú)立研究針對(duì)腫瘤細(xì)胞的自發(fā)和非自發(fā)通路及過(guò)程；2.  模擬人多步驟的癌癥形成過(guò)程，有續(xù)地進(jìn)行誘導(dǎo)突變；3. 開(kāi)展獨(dú)特的腫瘤治療靶點(diǎn)遺傳性評(píng)價(jià)。

腫瘤GEM模型構(gòu)建策略與技術(shù)方面的改進(jìn)

GEM模型因其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)已經(jīng)被證實(shí)是腫瘤學(xué)研究的有效工具，但研究者們也一直努力對(duì)其進(jìn)行著不斷改進(jìn)與完善。該類(lèi)小鼠模型由于在構(gòu)建與研制過(guò)程中周期長(zhǎng)，工作量大，以及成本高等原因，特別是對(duì)于多個(gè)等位遺傳位點(diǎn)進(jìn)行修飾，構(gòu)建具有遺傳特性的新突變小鼠模型，研制過(guò)程更耗時(shí)，且需要更長(zhǎng)久的交配繁殖過(guò)程。這也成為限制具有遺傳能力的GEM模型廣泛實(shí)際應(yīng)用的一個(gè)主要因素。近年來(lái)，由于腫瘤基因組序列研究技術(shù)的廣泛普及與應(yīng)用，以及隨著新發(fā)現(xiàn)的癌癥相關(guān)基因突變數(shù)量的快速增長(zhǎng)，更加需要建立快速新穎的小鼠模型研制策略，實(shí)現(xiàn)在體內(nèi)快速驗(yàn)證潛在致癌基因，以及建立已知病人相關(guān)突變的非生殖遺傳修飾GEM模型的目的。目前這方面的進(jìn)展主要有：ES細(xì)胞為基礎(chǔ)的腫瘤模型；應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)基因組編程；腫瘤病人相關(guān)位點(diǎn)的改善腫瘤模型。

 

1. ES細(xì)胞為基礎(chǔ)的腫瘤模型

為了進(jìn)一步加快新型人腫瘤GEM模型的研制，將小鼠胚胎干細(xì)胞（ESC）經(jīng)過(guò)基因修飾后而作為非遺傳修飾（如嵌合體）小鼠直接進(jìn)行腫瘤學(xué)研究已成為一種研究策略。最近報(bào)道的GEM-ESC策略，即建立以ES細(xì)胞為基礎(chǔ)的腫瘤GEM模型。該類(lèi)模型是在原有基因修飾的基礎(chǔ)上，快速構(gòu)建新型基因遺傳修飾小鼠模型。例如，應(yīng)用GEM-ESC策略，在原有K14cre-Brca1-Trp53(KBIP)的小鼠乳腺腫瘤模型的ESC上，直接導(dǎo)入MET原癌基因，構(gòu)建新型KBIP-MET的轉(zhuǎn)化乳腺癌模型。研究結(jié)果表明，與KBIP小鼠相比，此KBIP-MET小鼠形成的乳腺癌更具有轉(zhuǎn)化特征，表現(xiàn)為更容易形成癌肉瘤。在對(duì)腫瘤藥物的反應(yīng)性上，KBIP小鼠模型的乳腺癌對(duì)臨床RARP抑制劑（如Olaparib）敏感，而KBIP-MET小鼠模型的轉(zhuǎn)化乳腺腫瘤則顯示對(duì)該抑制劑具有耐受性。

2. 應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)的基因組編程

過(guò)去十年，伴隨新的基因組編程技術(shù)（如ZFNs和TALENs）快速發(fā)展，2013年出現(xiàn)CRISPR/Cas9基因組編程系統(tǒng)，該類(lèi)基因組編輯技術(shù)成為繼PCR技術(shù)發(fā)展以來(lái)，過(guò)去幾年生物學(xué)研究領(lǐng)域的有革命性進(jìn)步的及影響力最大的技術(shù)更新。CRISPR/Cas9系統(tǒng)首先發(fā)現(xiàn)于原核生物中針對(duì)抵抗外來(lái)入侵遺傳物質(zhì)而建立的免疫系統(tǒng)，并很快被成功用于各類(lèi)物種的基因編輯。借助單一的引導(dǎo)RNA（sgRNAs)，Cas9核酸酶成為能特異性作用于基因組任何基因位點(diǎn)，達(dá)到基因敲除的目的。通過(guò)應(yīng)用Cas9誘導(dǎo)的DNA斷裂和單鏈核苷酸/供體DNA，該系統(tǒng)也可實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因突變，或特定插入loxP/FRT重組位點(diǎn)等進(jìn)行遺傳修飾。

CRISPR/Cas9技術(shù)系統(tǒng)所表現(xiàn)出的同時(shí)對(duì)基因組不同位點(diǎn)進(jìn)行有效編輯等基因打靶策略特征，使其立刻成為快速研制腫瘤小鼠模型的最佳選擇。目前在人腫瘤病人觀察的所有遺傳突變都可以通過(guò)基因修飾的方法來(lái)快速地構(gòu)建相應(yīng)的小鼠模型，包括條件性基因敲除，點(diǎn)突變，易位等。另外，也有研究者應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)小鼠的致癌基因和TSGs進(jìn)行了體細(xì)胞（非生殖遺傳性）編輯，因?yàn)榇搜芯坎呗缘呐�力與成功，使該系統(tǒng)成為研制肝細(xì)胞腫瘤，肺癌，腦癌，胰腺癌，以及乳腺癌的非遺傳修飾模型的新方法。

最近，CRISPR/Cas9系統(tǒng)也應(yīng)用于靶基因的抑制（CRISPRi）或激活（CRISPRa)的遺傳修飾。這類(lèi)修飾系統(tǒng)可用于研制相應(yīng)致癌基因，和/或抑制TSGs基因的誘導(dǎo)和可逆激活小鼠模型。比如借助CRISPRa為基礎(chǔ)的系統(tǒng)，通過(guò)激活致癌基因的轉(zhuǎn)錄，達(dá)到研究其致癌潛力的目的。

雖然CRISPR/Cas9為基礎(chǔ)的基因編輯系統(tǒng)非常具有潛力，但該系統(tǒng)應(yīng)用于體內(nèi)基因編輯也存在一定的缺陷，比如，目前該系統(tǒng)策略不適合于驗(yàn)證潛在致癌基因的致癌潛力。另外，將Cas9導(dǎo)入體細(xì)胞的基因編輯方式，可引起Cas9特異性免疫反應(yīng)，導(dǎo)致Cas9表達(dá)細(xì)胞有被清除的可能性。為了避免這些可能的潛在風(fēng)險(xiǎn)，可選擇在免疫缺陷小鼠體內(nèi)進(jìn)行相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)，或通過(guò)基因修飾方法，首先獲得對(duì)Cas9具有免疫學(xué)耐受小鼠模型后，再開(kāi)展相應(yīng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。最后，雖然已有報(bào)道表明，應(yīng)用引起DNA單鏈斷開(kāi)的可誘導(dǎo)Cas9n缺口酶，可以降低其脫靶效應(yīng)， 但研究者在實(shí)際應(yīng)用中必須有清晰認(rèn)識(shí)，要想完全避免由CRISPR/Cas9介導(dǎo)的非設(shè)計(jì)所需要的脫靶突變是很難的。

3. 腫瘤病人相關(guān)位點(diǎn)的改善腫瘤模型

構(gòu)建理想的腫瘤病人相關(guān)突變模型，對(duì)研究靶基因在腫瘤發(fā)生過(guò)程中的作用，以及有效評(píng)價(jià)藥物效應(yīng)就顯得很有必要性與實(shí)際意義。因?yàn)樵谌四[瘤抑制基因（TSGs）中，許多具有腫瘤形成依賴(lài)的生殖細(xì)胞突變和體細(xì)胞突變都是錯(cuò)義或無(wú)義突變，從而導(dǎo)致突變產(chǎn)物或可能帶有功能截短蛋白的形成。這類(lèi)突變現(xiàn)象是難以通過(guò)條件性敲除小鼠模型來(lái)實(shí)現(xiàn)的，因?yàn)闂l件性基因修飾策略是將靶基因中某個(gè)或幾個(gè)外顯子完全敲除，達(dá)到滅活靶基因功能。一些研究結(jié)果已經(jīng)表明，參照腫瘤病人相關(guān)TSG突變構(gòu)建的小鼠突變模型，可產(chǎn)生與靶基因完全敲除不同的表型。比如，與Trp53基因敲除小鼠比較，病人相關(guān)的Trp53熱點(diǎn)突變小鼠表現(xiàn)有更加明顯的致癌活性。

同樣，構(gòu)建BRCA1乳腺癌病人相關(guān)的Brca1基因突變的條件性小鼠模型研究表明，與Brac1完全敲除小鼠模型相比，因Brac1基因中特定RING區(qū)域引入突變而引起的乳腺腫瘤，更容易對(duì)那些破壞DNA的藥物產(chǎn)生耐受性，因?yàn)槠銪RCA1蛋白含有較少的RING活性的緣故。研究也證實(shí)，由于突變導(dǎo)致Brac1蛋白含有較少的RING活性 ，表現(xiàn)為更容易對(duì)那些破壞DNA的藥物產(chǎn)生耐受性，該結(jié)果有助于揭示這些突變與治療反應(yīng)效果之間的因果關(guān)系。

GEM模型在腫瘤學(xué)研究中的應(yīng)用范圍

作為原發(fā)腫瘤發(fā)生的GEM模型，可成為體內(nèi)分析包括腫瘤形成，發(fā)展及轉(zhuǎn)移中腫瘤形成等過(guò)程中細(xì)胞本身與細(xì)胞間相互作用的系統(tǒng)選擇。人腫瘤GEM模型也已成功應(yīng)用于驗(yàn)證候選藥物靶點(diǎn)，評(píng)估治療效果，以及評(píng)價(jià)藥物耐受機(jī)制等方面。由于GEM模型是在具有完整免疫系統(tǒng)的小鼠體內(nèi)形成原發(fā)腫瘤，因此，該類(lèi)模型更適合潛在腫瘤免疫治療的探索性研究。建立基因修飾小鼠模型與人疾病緊密相關(guān)性研究的策略與方法，為探索與開(kāi)發(fā)腫瘤治療新方法與策略提供了有意義的應(yīng)用平臺(tái)。也為設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)新抗腫瘤治療，提供了臨床治療效果等相關(guān)信息。GEM模型在以下幾個(gè)方面對(duì)腫瘤生物學(xué)及轉(zhuǎn)化腫瘤學(xué)等研究進(jìn)展及貢獻(xiàn)中發(fā)揮了重要作用。

1. 驗(yàn)證潛在癌基因

在大量腫瘤樣品測(cè)序研究獲得不斷增加的潛在腫瘤基因基礎(chǔ)上，建立體內(nèi)快速驗(yàn)證這些潛在腫瘤相關(guān)基因的策略是非常必要和有實(shí)際意義的�？紤]到速度和相對(duì)簡(jiǎn)單化因素，GEM-ESC和CRISPR/Cas9技術(shù)可作為快速驗(yàn)證潛在腫瘤基因的首選方法。特別是應(yīng)用基于體細(xì)胞的CRIPPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)，建立非遺傳修飾的小鼠模型，實(shí)現(xiàn)高通量體內(nèi)驗(yàn)證潛在腫瘤基因的目的。比如，應(yīng)用DNA注射與活體電穿孔相結(jié)合的轉(zhuǎn)染方法，將引起胰腺管腺癌（PDAC）的13個(gè)不同的主要腫瘤抑制相關(guān)基因的15個(gè)gRNAs/Cas9表達(dá)質(zhì)粒混合物一起導(dǎo)入成熟小鼠的胰腺，構(gòu)建同時(shí)修飾此13個(gè)基因的小鼠模型。結(jié)果顯示，此PDAC小鼠有超過(guò)60%的這些靶基因顯示基因敲除，提示CRISPR/Cas9介導(dǎo)的突變誘發(fā)了腫瘤的形成。同樣，利用Dox誘導(dǎo)Cas9表達(dá)的GEM模型也被用于驗(yàn)證已知的多種腸道腫瘤基因（如Apc和Trp53）。除了修飾TSGs, CRISPR/Cas9技術(shù)還應(yīng)用于驗(yàn)證染色體重排的致癌性，如在肺癌病人觀察到的Eml4-Alk基因的融合現(xiàn)象。

另外，應(yīng)用GEM模型對(duì)來(lái)自臨床病人并篩選獲得的候選潛在癌基因進(jìn)行驗(yàn)證，也已成為研究腫瘤相關(guān)基因功能的常用策略。例如，最近胡卓偉教授課題組通過(guò)構(gòu)建條件性過(guò)表達(dá)和敲除GEM模型，研究假激酶Trib3基因在促進(jìn)急性早幼粒細(xì)胞白血�。ˋPL）形成中的作用，結(jié)果表明，同時(shí)在小鼠骨髓細(xì)胞中特異性表達(dá)或敲除Trib3與 致癌蛋白PML-RARa (PR) 融合基因，Trib3基因可顯著增加PR誘發(fā)APL形成的作用。而呂毅教授課題組則是通過(guò)構(gòu)建Y染色體性別決定區(qū)（Sry) 基因特異性表達(dá)的GEM模型，首次證實(shí)了在肝組織內(nèi)特異性過(guò)表達(dá)Sry基因雄/雌小鼠對(duì)化學(xué)致癌劑（DEN）誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞癌（HCC）形成更加敏感，提示Sry基因在HCC形成過(guò)程中發(fā)揮了重要的促進(jìn)作用。

2. 研究致癌基因的依賴(lài)性

致癌基因依賴(lài)現(xiàn)象是指某些腫瘤形成完全依賴(lài)于單一致癌基因。由于條件性GEM模型對(duì)基因的修飾是不可逆的，因而不適合研究致癌基因依賴(lài)性。因此需要選擇不同的調(diào)控誘導(dǎo)策略進(jìn)行相應(yīng)的研究，例如將致癌基因與ERT融合達(dá)到控制其表達(dá)的目的。有研究報(bào)道，將Trp53-ERT變異體取代內(nèi)源Trp53建立的純合敲入小鼠，該Trp53-ERT小鼠只有在Tamoxifen存在條件下，誘導(dǎo)Trp53的表達(dá)，并在已形成腫瘤小鼠模型的基礎(chǔ)上，研究再恢復(fù)p53功能后對(duì)已有腫瘤的影響。研究結(jié)果表明，在Eu-Myc引起的淋巴瘤基礎(chǔ)上，恢復(fù)Trp53活性可產(chǎn)生快速細(xì)胞凋亡，明顯增加小鼠的存活率。另外，多西霉素（Doxycycline，Dox）調(diào)控基因表達(dá)的可逆誘導(dǎo)系統(tǒng)也被應(yīng)用于GEM模型的建立，通過(guò)該系統(tǒng)誘導(dǎo)人MYC原癌基因的表達(dá)后，引起腫瘤的形成。在關(guān)閉MYC基因表達(dá)后觀察，導(dǎo)致原癌基因失活后，已形成的腫瘤的相應(yīng)反應(yīng)。該研究是應(yīng)用Dox的Tet-off誘導(dǎo)系統(tǒng)，持續(xù)在小鼠造血干細(xì)胞中特異表達(dá)人MYC轉(zhuǎn)基因，誘導(dǎo)小鼠形成惡性T細(xì)胞淋巴瘤和急性髓系白血病，在此基礎(chǔ)上，如果通過(guò)添加Dox誘導(dǎo)劑使MYC表達(dá)停止后，發(fā)現(xiàn)已表現(xiàn)出的腫瘤表型也隨之消弱，并證實(shí)此過(guò)程與腫瘤細(xì)胞周期死亡有關(guān)。研究也發(fā)現(xiàn)，對(duì)于此可逆誘導(dǎo)系統(tǒng)中停止激活MYC表達(dá)后的長(zhǎng)期效果，不同的腫瘤類(lèi)型是有區(qū)別的。如在骨肉瘤中短暫抑制MYC表達(dá)，因?yàn)槿饬黾?xì)胞分化為成熟的骨細(xì)胞，所以會(huì)出現(xiàn)肉瘤持續(xù)萎縮的現(xiàn)象。相反，雖然MYC表達(dá)抑制會(huì)引起肝癌出現(xiàn)彌漫性的萎縮，但是，存留的腫瘤細(xì)胞仍處于潛伏狀態(tài)，并在重新開(kāi)啟MYC表達(dá)后，可以很快恢復(fù)其腫瘤特征。

3. 破解自發(fā)性轉(zhuǎn)移形成機(jī)制

盡管有不斷改善的腫瘤治療選擇策略，轉(zhuǎn)移疾病仍然是引起癌癥死亡的主要原因。轉(zhuǎn)移過(guò)程是通過(guò)腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境相互持續(xù)作用而形成的復(fù)雜的多步驟過(guò)程。過(guò)去絕大多數(shù)的臨床前轉(zhuǎn)移研究是借助細(xì)胞系接種模型來(lái)實(shí)施的，而這類(lèi)模型不能真實(shí)反映腫瘤病人的轉(zhuǎn)移過(guò)程。GEM模型可引起原發(fā)腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移形成，因而是研究過(guò)去未知的腫瘤自發(fā)轉(zhuǎn)移形成過(guò)程不可缺少的工具。由于原發(fā)腫瘤的過(guò)度生長(zhǎng)，在大范圍轉(zhuǎn)移形成之前，小鼠一般不得不被處死，這也是GEM模型潛在的不足之處。這一局限可以通過(guò)將GEM來(lái)源的腫瘤組織進(jìn)行原位移植的方式解決，比如通過(guò)手術(shù)移植方式，達(dá)到保留供體腫瘤的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性效果，使其轉(zhuǎn)移過(guò)程的發(fā)生接近臨床上的常見(jiàn)轉(zhuǎn)移疾病。

應(yīng)用GEM模型研究腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程已獲得了某些重要的發(fā)現(xiàn)。過(guò)去的研究認(rèn)為腫瘤轉(zhuǎn)移是發(fā)生在腫瘤形成過(guò)程晚期。然而，通過(guò)BALB-NeuT和MMTV-PyMT小鼠乳腺腫瘤模型的研究表明，來(lái)自早期的損傷轉(zhuǎn)染細(xì)胞已經(jīng)具有傳播至骨髓和肺組織而形成微小轉(zhuǎn)移瘤的能力。另外，上皮細(xì)胞至間葉細(xì)胞間的轉(zhuǎn)移（EMT）被認(rèn)為在腫瘤細(xì)胞傳播和轉(zhuǎn)移方面起到了非常重要的作用。然而，應(yīng)用胰腺癌和乳腺癌GEM模型的研究表明，腫瘤細(xì)胞不僅保留了其上皮細(xì)胞特征，卻還能在轉(zhuǎn)移病灶位置出現(xiàn)，提示EMT在這些模型中的腫瘤轉(zhuǎn)移形成并不是必須的。再有，在探索腫瘤轉(zhuǎn)移形成過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞與免疫系統(tǒng)之間復(fù)雜關(guān)聯(lián)方面，GEM模型明顯發(fā)揮了突出的關(guān)鍵作用。例如，骨髓免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，在促進(jìn)不同種癌癥的轉(zhuǎn)移形成方面，起到了至關(guān)重要的作用。最近有研究報(bào)道表明，乳腺腫瘤引起系統(tǒng)炎癥，即由IL17-產(chǎn)生的T細(xì)胞及繼發(fā)的免疫抑制中性粒細(xì)胞的擴(kuò)增，可引發(fā)小葉乳腺癌GEM模型的自發(fā)性轉(zhuǎn)移形成，導(dǎo)致GEM移植模型的自發(fā)轉(zhuǎn)移疾病。

GEM模型在揭示相關(guān)基因參與抑制腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制方面也發(fā)揮了重要作用。最近，劉寶華課題組應(yīng)用Tet-ON可誘導(dǎo)Sirt7表達(dá)的GEM模型，揭示了Sirt7抑制原發(fā)胰腺癌轉(zhuǎn)移作用機(jī)制，該研究結(jié)果證實(shí)，由Dox誘導(dǎo)表達(dá)的Sirt7具有明顯抑制MMTV-PyMT小鼠乳腺腫瘤肺轉(zhuǎn)移的作用，且其作用機(jī)制是通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

因此，GEM模型在揭示腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)雜性，挑戰(zhàn)當(dāng)下普遍接受的理論(即腫瘤轉(zhuǎn)移是晚期癌癥細(xì)胞包括EMT在內(nèi)的轉(zhuǎn)移過(guò)程)等方面，都發(fā)揮了不可缺少的作用。這些重要的發(fā)現(xiàn)有可能為轉(zhuǎn)移癌癥病人的治療提供重要的參考依據(jù)。

4. 研究腫瘤微環(huán)境作用

在揭示腫瘤細(xì)胞外部因子（如癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs) 和免疫細(xì)胞）如癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs) 和免疫細(xì)胞與腫瘤形成過(guò)程等作用方面，GEM模型已發(fā)揮了不可取代的作用。CAFs可通過(guò)合成細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分（如膠原蛋白，纖維連接蛋白，層粘連蛋白）來(lái)調(diào)控ECM和基底膜形成。而且，CAFs是各種可溶性介導(dǎo)物包括基體金屬蛋白酶（MMPs)的來(lái)源, 在促使ECM轉(zhuǎn)化，加強(qiáng)其在維持ECM動(dòng)態(tài)平衡方面有著重要作用。GEM模型研究已表明，CAFs在腫瘤形成過(guò)程中具有雙重作用。利用K4-HPV6鱗狀皮膚癌小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，在上皮細(xì)胞惡性癌轉(zhuǎn)化過(guò)程中，CAFs能通過(guò)增強(qiáng)炎癥，血管形成，以及ECM重新組成，從而刺激腫瘤的發(fā)展。

相反，通過(guò)兩個(gè)獨(dú)立的胰腺癌GEM模型的研究表明，在體內(nèi)抑制CAFs具有加速腫瘤形成過(guò)程的效果，提示CAFs對(duì)腫瘤的阻止作用。如此相互矛盾的現(xiàn)象對(duì)于免疫細(xì)胞來(lái)說(shuō)則是可以理解的，起初免疫細(xì)胞被認(rèn)為是可通過(guò)攻擊轉(zhuǎn)化腫瘤的細(xì)胞，抑制腫瘤形成過(guò)程。然而，最近的研究表明，這些免疫細(xì)胞也具有促進(jìn)腫瘤的功能。應(yīng)用小鼠模型對(duì)一些不同的腫瘤類(lèi)型的研究已揭示了炎癥與腫瘤之間的相互關(guān)系。例如，應(yīng)用大腸炎相關(guān)癌癥的小鼠模型，在髓系免疫細(xì)胞中特異性敲除NF-jB信號(hào)系統(tǒng)后，減緩小鼠腫瘤生長(zhǎng)，表明其具有促進(jìn)腫瘤的作用。

另外，K4-HPV6小鼠模型研究也表明，肥大細(xì)胞與骨髓來(lái)源細(xì)胞借助MMP9激活血管生成和重新調(diào)整基質(zhì)結(jié)構(gòu)等方式，發(fā)揮其促進(jìn)鱗狀皮膚癌形成作用。應(yīng)用同樣的皮膚癌癥模型發(fā)現(xiàn)，慢性炎癥有促進(jìn)新生腫瘤形成的作用。至此，人們已經(jīng)開(kāi)始對(duì)炎癥誘導(dǎo)腫瘤的相關(guān)巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的促進(jìn)作用進(jìn)行研究。例如，在MMTV-PyMT乳腺癌小鼠模型基礎(chǔ)上，將一種重要的巨噬細(xì)胞相關(guān)基因CSF1 （Colony-stimulating factor1 ）敲除后發(fā)現(xiàn)，該小鼠的乳腺腫瘤惡性化過(guò)程被延緩。同樣，抑制CXCR2（一種介導(dǎo)中性粒細(xì)胞遷移的趨化因子）則有抑制APC小鼠的腸道腫瘤形成的效果。總之，這些研究強(qiáng)調(diào)了免疫細(xì)胞在腫瘤發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中，發(fā)揮了協(xié)同參與調(diào)控的作用。

5. 確定腫瘤細(xì)胞的來(lái)源

揭示腫瘤發(fā)生過(guò)程中的細(xì)胞來(lái)源將為開(kāi)發(fā)與改善治療策略提供非常重要的理論基礎(chǔ)。應(yīng)用GEM模型已經(jīng)成功闡明了某些不同腫瘤類(lèi)型的細(xì)胞起源。在小細(xì)胞肺癌（SCLC）研究中，通過(guò)氣管內(nèi)注射細(xì)胞特異性的Adeno-Cre病毒載體，使Trp53和Rb1兩基因分別在Clara細(xì)胞, 神經(jīng)內(nèi)分泌的（NE）細(xì)胞，以及II型肺泡（SPC）細(xì)胞被特異性敲除，分析腫瘤發(fā)生的不同時(shí)間和腫瘤表型等。結(jié)果表明，相對(duì)于SPC細(xì)胞，NE細(xì)胞是造成SCLC形成的主要細(xì)胞來(lái)源。另外，細(xì)胞來(lái)源的研究也能提供與以前研究結(jié)果不一樣的意外結(jié)果。比如，過(guò)去以BRCA1為基礎(chǔ)的乳腺癌研究認(rèn)為，該類(lèi)癌癥的來(lái)源細(xì)胞是基底上皮干細(xì)胞。而在應(yīng)用GEM模型對(duì)BRCA1引起的基底樣乳腺癌研究中發(fā)現(xiàn)，其實(shí)管腔祖細(xì)胞才是基底樣腫瘤的真正來(lái)源。

最近來(lái)自?xún)蓚�(gè)不同實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明，遺傳變異（如Pik3ca突變）可顯著地影響干細(xì)胞庫(kù)組成。Pik3ca點(diǎn)突變（如H047R）引起具有譜系特征的乳腺上皮細(xì)胞分化為多能干細(xì)胞樣狀態(tài)能力損失。而且，Pik3ca乳腺腫瘤的細(xì)胞來(lái)源主導(dǎo)了其惡性程度，表明了在改善抗癌癥藥物及治療效果的特異性方面，準(zhǔn)確找到腫瘤細(xì)胞來(lái)源具有非常重要的實(shí)際意義。

6. 驗(yàn)證新藥物靶點(diǎn)

考慮到不是所有的癌基因都是維持腫瘤形成所必須的，因此，在針對(duì)相應(yīng)的靶點(diǎn)藥物，開(kāi)展人體臨床試驗(yàn)前，即在臨床前的動(dòng)物體內(nèi)，驗(yàn)證滅活TSG，或者降低致癌基因是否能引起進(jìn)行中腫瘤的萎縮成為非常重要的試驗(yàn)。應(yīng)用可誘導(dǎo)小鼠模型可實(shí)現(xiàn)對(duì)致癌基因維持腫瘤相關(guān)性的驗(yàn)證，如在乳腺癌小鼠模型中，癌基因Pik3ca表達(dá)去誘導(dǎo)后，引起部分腫瘤的萎縮，提示這些腫瘤是與“依賴(lài)”廣泛性活性P13K信號(hào)密切相關(guān)的。然而，多數(shù)腫瘤最終因Met或Myc增加而復(fù)發(fā)，提示這些遺傳損傷可能會(huì)誘導(dǎo)對(duì)P13K抑制劑的耐受性。此例子說(shuō)明可誘導(dǎo)GEM模型應(yīng)用于臨床前研究，不僅可達(dá)到驗(yàn)證藥物靶點(diǎn)的目的，而且對(duì)揭示藥物耐受性的形成機(jī)制也具有其實(shí)際意義。

TSG也有可能成為有效的藥物靶點(diǎn)。由于p53基因的顯性負(fù)作用或抑制突變，以及其特異性抑制劑MDM2和MDM4的增加/過(guò)表達(dá)等的原因，導(dǎo)致腫瘤中的p53功能喪失。應(yīng)用可逆轉(zhuǎn)抑制p53活性的GEM模型遺傳學(xué)研究表明，重新恢復(fù)p53基因功能，可快速使已形成的腫瘤消退，提示研制抑制MDM2分子，從而恢復(fù)p53功能，或?qū)⑼蛔冃蚿53重新恢復(fù)為具有野生型功能p53的抗腫瘤藥物的臨床意義。同樣，應(yīng)用可誘導(dǎo)敲低APC的GEM模型研究結(jié)直腸癌的結(jié)果也表明，誘導(dǎo)恢復(fù)APC功能后，可迅速引起快速與廣泛的腫瘤細(xì)胞分化和持續(xù)的無(wú)復(fù)發(fā)萎縮，這為體內(nèi)評(píng)價(jià)APC/Wnt通路作為APC突變引起的結(jié)直腸癌的治療靶點(diǎn)提供了依據(jù)。

7. 闡明治療效應(yīng)與耐受

為了將臨床試驗(yàn)中抗腫瘤新療法失敗的風(fēng)險(xiǎn)盡量降低到最低，建立臨床前高效及預(yù)測(cè)性強(qiáng)的體內(nèi)模型，客觀評(píng)估相應(yīng)藥物效應(yīng)及耐受性就顯得更加重要。通過(guò)Kras突變引起的肺癌和胰腺癌的GEM模型的研究發(fā)現(xiàn)，GEM模型對(duì)靶向治療和傳統(tǒng)化療的應(yīng)答效應(yīng)與相應(yīng)病人的應(yīng)答性具有非常大的相似性。需要加以關(guān)注的是小鼠與人在藥物代謝方面表現(xiàn)明顯不同，比如，參與肝臟藥物代謝的細(xì)胞色素P450酶底物特異性方面，不同的物種存在較大的差異。該類(lèi)問(wèn)題可借助人源化小鼠模型加以解決。因此，建立人源化的GEM模型作為臨床前藥物效果的研究，將有助于優(yōu)化針對(duì)靶特異抗腫瘤藥物的研發(fā)，以及尋找與確定治療效應(yīng)的關(guān)鍵因素，并使其成為腫瘤病人特征的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)記。另外，GEM模型也可應(yīng)用于探索治療敏感性腫瘤獲得性耐藥的形成機(jī)制。

在探討腫瘤治療效應(yīng)與耐受機(jī)制方面，K14cre; Brca1-f/f; Trp53-f/f (KB1P) 小鼠是作為BRCA1突變?nèi)橄侔┡R床前GEM模型的一個(gè)非常有說(shuō)服力的例子。KB1P小鼠可形成完全模擬類(lèi)人BRCA1突變?nèi)橄侔┙M織病理學(xué)特征的乳腺腫瘤，而且，對(duì)含鉑類(lèi)藥物和PARP抑制劑也具有高敏感性。臨床試驗(yàn)證實(shí)，PARP抑制劑Olaparib可以治療卵巢腫癌，乳腺癌和結(jié)直腸癌。 雖然該藥物并不對(duì)所有這類(lèi)癌癥病人的治療都有效果，但其對(duì)BRCA1突變攜帶者表現(xiàn)有明顯治療效果，可能與PARP抑制劑合用引起的協(xié)同致死作用與BRCA1缺乏有關(guān)。BRCA1突變細(xì)胞對(duì)PARP抑制劑表現(xiàn)為更加容易被損傷，因?yàn)镻ARP抑制劑誘發(fā)的單一鏈DNA斷裂，可導(dǎo)致DNA復(fù)制時(shí)的雙鏈斷裂，造成BRCA1缺失細(xì)胞無(wú)法實(shí)施同源重組機(jī)制來(lái)修復(fù)損傷的DNA。

根據(jù)Olaparib在臨床試驗(yàn)中獲得的理想效果，F(xiàn)DA于2014年12月批準(zhǔn)了該藥用于BRCA1/2突變卵巢癌病人的治療。盡管病人對(duì)該藥物有很好的反應(yīng)效果，然而，在病人和GEM模型研究中都發(fā)現(xiàn)了獲得性藥物耐受性。通過(guò)臨床前KB1P小鼠模型研究證實(shí)，這類(lèi)耐藥機(jī)制與藥物運(yùn)輸物及同源重組恢復(fù)等數(shù)量的增加有關(guān)。這些研究結(jié)果有助于了解臨床上耐藥性的產(chǎn)生, 以及設(shè)計(jì)針對(duì)Olaparib耐藥病人的改進(jìn)治療策略。

關(guān)于腫瘤治療效應(yīng)與藥物耐受性的關(guān)系，現(xiàn)在也是越來(lái)越清楚，即其影響不僅受腫瘤細(xì)胞自身因素，而且與成纖維細(xì)胞和免疫細(xì)胞等基質(zhì)因素有關(guān)。通過(guò)PDAC的GEM模型進(jìn)行腫瘤干預(yù)研究的結(jié)果表明，治療是抑制旁泌性相關(guān)信號(hào)通路，減少促結(jié)締組織增生腫瘤基質(zhì)，增加腫瘤脈管系統(tǒng)，導(dǎo)致促進(jìn)抗腫瘤藥物導(dǎo)入腫瘤部位的過(guò)程。然而，關(guān)于攻擊PDAC中的腫瘤基質(zhì)的概念，最近有兩個(gè)研究對(duì)該理論進(jìn)行了挑戰(zhàn)。這兩研究結(jié)果表明，基質(zhì)因素可能通過(guò)阻止腫瘤血管形成，引起不是促進(jìn)而是抑制PDAC生長(zhǎng)。所以，這些研究都揭示了腫瘤微環(huán)境在治療耐受性方面，發(fā)揮了比過(guò)去想象的更加重要的，且復(fù)雜的作用。

8. 腫瘤免疫治療

在過(guò)去十年，通過(guò)對(duì)免疫反應(yīng)的深刻揭示與認(rèn)識(shí)，建立了利用病人免疫系統(tǒng)攻擊腫瘤的治療策略。近年來(lái)的黑色素瘤和肺癌臨床病人試驗(yàn)已證實(shí)，包括抗CTLA-4和抗PD-1的免疫檢查點(diǎn)抑制物，在增強(qiáng)病人有效抗腫瘤免疫及改善生存率等方面具有巨大潛力。這些臨床試驗(yàn)基礎(chǔ)是來(lái)自過(guò)去幾十年在實(shí)驗(yàn)小鼠模型上開(kāi)展的基礎(chǔ)研究，從而揭示了CTLA-4和PD-1在阻止免疫反應(yīng)中的重要性，特別是通過(guò)對(duì)CTLA-4和PD-1敲除小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重與溫和程度的自發(fā)性自身免疫表型的明確證實(shí)，應(yīng)用CTLA-4抑制物引起接種腫瘤小鼠的抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)增加，產(chǎn)生腫瘤排斥作用，提示釋放T細(xì)胞上的剎車(chē)可能是抵抗腫瘤的一個(gè)潛力的應(yīng)對(duì)策略。盡管如此，同時(shí)也應(yīng)該清楚的了解，仍有一定比例的病人對(duì)此類(lèi)免疫治療沒(méi)有反應(yīng)，且目前的挑戰(zhàn)是還不知道其真正原因。

目前，雖然絕大部分的免疫學(xué)研究都是在腫瘤移植小鼠模型的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，但就現(xiàn)在研究情況預(yù)測(cè)表明，今后GEM模型應(yīng)用于該領(lǐng)域的研究將會(huì)越來(lái)越多。應(yīng)用GEM模型研究的部分結(jié)果表明，在新形成的腫瘤過(guò)程中，因腫瘤引起的耐受機(jī)制，T細(xì)胞喪失其對(duì)腫瘤細(xì)胞的反應(yīng)性，特別明顯的是，如果將來(lái)自GEM模型小鼠形成的腫瘤細(xì)胞，接種至免疫缺陷小鼠體內(nèi)，腫瘤會(huì)快速生長(zhǎng)，而野生小鼠則能排斥這些腫瘤細(xì)胞。提示這些腫瘤細(xì)胞沒(méi)有失去其免疫原性，T細(xì)胞仍然能識(shí)別這些細(xì)胞并發(fā)揮其攻擊作用。但在原發(fā)腫瘤小鼠的體內(nèi)這些T細(xì)胞卻無(wú)能為力。

腫瘤常常被認(rèn)為是慢性炎癥的結(jié)果，這種炎癥可引起局部和系統(tǒng)免疫抑制，從而不利于T細(xì)胞發(fā)揮其有效的功能。而且，腫瘤常表現(xiàn)為樹(shù)狀突細(xì)胞（DC)功能缺失，導(dǎo)致T細(xì)胞啟動(dòng)缺損。例如，在MMTV-PyMT乳腺腫瘤小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，原本具有潛在激活抗腫瘤T細(xì)胞的DC細(xì)胞，會(huì)被大量存在的巨噬細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)抑制，這些巨噬細(xì)胞起到了阻止特定T細(xì)胞激活的作用。最近的研究也證實(shí)，促進(jìn)DC細(xì)胞功能或阻止骨髓細(xì)胞引起的免疫抑制，可以達(dá)到改善免疫檢查點(diǎn)抑制物的抗腫瘤效果。因此，對(duì)腫瘤病人實(shí)施耐受T細(xì)胞免疫激活療法的時(shí)候，結(jié)合應(yīng)用針對(duì)改善免疫抑制或則增強(qiáng)T細(xì)胞啟動(dòng)的靶點(diǎn)藥物，在臨床上可能會(huì)起到更好的治療效果。

相對(duì)于腫瘤接種模型，應(yīng)用GEM模型進(jìn)行免疫治療研究需要不同的方法。考慮到GEM模型中腫瘤是在每個(gè)獨(dú)立小鼠體內(nèi)發(fā)生的，如同病人腫瘤的發(fā)生過(guò)程，具有特殊的腫瘤抗原。因而，具有其異質(zhì)性的特點(diǎn)，從而確保區(qū)別鑒定反應(yīng)和非反應(yīng)腫瘤之間的分子不同，也有助于臨床預(yù)測(cè)的生物標(biāo)記物的建立。然而，對(duì)于大多數(shù)GEM模型來(lái)源的腫瘤來(lái)說(shuō)，辨認(rèn)可被T細(xì)胞識(shí)別的表達(dá)腫瘤抗原卻是未知的。為了克服這點(diǎn)，可借助基因修飾的方式，將臨床上相關(guān)腫瘤抗原引入小鼠體內(nèi)，使其具有誘發(fā)腫瘤特異性T細(xì)胞反應(yīng)的效果。比如，應(yīng)用低免疫原性的腫瘤（如肉瘤和肺癌），將腫瘤特異性抗原引入至GEM模型后，這些腫瘤的免疫原性增加，引起潛在而短時(shí)間的抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)。起初的抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)很快發(fā)生，然后是可調(diào)控T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制。因此，這些模型將有助于目前與未來(lái)相關(guān)研究，以達(dá)到揭示免疫逃逸的復(fù)雜機(jī)制，最終研發(fā)具有改善的腫瘤免疫治療的新策略的目的。

9. 與臨床試驗(yàn)并行的GEM模型

最近推出的“與臨床共試驗(yàn)” 范例，目的是將臨床前GEM實(shí)驗(yàn)與人體臨床試驗(yàn)同時(shí)開(kāi)展，從而達(dá)到預(yù)測(cè)治療效果的作用。該策略已經(jīng)應(yīng)用于前列腺癌治療中，并成功揭示了由雄性激素誘發(fā)的耐受性與某些遺傳關(guān)鍵因子有關(guān)，以及克服去勢(shì)難治性的新綜合療法。同樣，應(yīng)用NSCLC的GEM模型的一起臨床試驗(yàn)表明，Kras/Lkb1突變肺癌較Kras or Kras/p53突變腫瘤對(duì)臨床上的Docetaxel和MEK抑制劑Selumetinib的聯(lián)合療法，表現(xiàn)為更加具有耐受性。揭示了LKB1是臨床試驗(yàn)中對(duì)此類(lèi)藥物聯(lián)合療法耐受的潛在決定因素。這類(lèi)研究表明，應(yīng)用GEM模型作為人腫瘤臨床前藥物效果研究，能發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)記物和聯(lián)合療法。

GEM在腫瘤學(xué)研究中發(fā)展趨勢(shì)與未來(lái)展望

許多抗腫瘤藥物在臨床試驗(yàn)中未能達(dá)到臨床前實(shí)驗(yàn)的期望目的，已經(jīng)成為目前腫瘤學(xué)與轉(zhuǎn)化癌癥醫(yī)學(xué)所面臨的巨大挑戰(zhàn)，如何改善腫瘤學(xué)領(lǐng)域的臨床前研究結(jié)果的預(yù)測(cè)性，也是人們十分關(guān)注的熱點(diǎn)。因此，如何選擇更能真實(shí)反映人腫瘤疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程的臨床前腫瘤動(dòng)物模型，將顯得更加重要了。為了實(shí)現(xiàn)這一目的，首先需要考慮的是如何建立能真實(shí)反映腫瘤本身及外在特征的臨床前小鼠模型。比如，臨床前模型應(yīng)該含有病人特異性突變，該種突變具有誘發(fā)惡性腫瘤的趨勢(shì)，且在一定病人群中顯示遺傳變化特征。另外，原發(fā)的腫瘤過(guò)程是在自然微環(huán)境中進(jìn)行的，如同在人腫瘤進(jìn)行過(guò)程中所見(jiàn)的腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境之間相互作用（包括免疫細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，以及淋巴細(xì)胞和血管的潛入）。再有，由于絕大多數(shù)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的病人已經(jīng)是處于廣泛腫瘤轉(zhuǎn)移疾病過(guò)程中，因此，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)就應(yīng)該考慮選擇能模擬病人疾病不同進(jìn)程狀態(tài)的小鼠模型，開(kāi)展相應(yīng)的臨床前的藥物效果評(píng)估研究。在現(xiàn)實(shí)的臨床試驗(yàn)中，往往進(jìn)入臨床試驗(yàn)的病人之前多是經(jīng)過(guò)不同程度的治療，因而極有可能會(huì)干擾治療效果的驗(yàn)證。而臨床前的動(dòng)物研究則是建立在從來(lái)沒(méi)有接受任何治療的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，從而導(dǎo)致高估治療效果的結(jié)果。從另外一方面講，臨床試驗(yàn)中對(duì)那些接受過(guò)治療的嚴(yán)重病人沒(méi)有效果，卻仍有可能對(duì)沒(méi)有接受過(guò)治療的嚴(yán)重病人有益處。

最近基因修飾模式動(dòng)物技術(shù)的進(jìn)展，促進(jìn)了快速研制更加精準(zhǔn)的能引起原發(fā)腫瘤的小鼠模型，該類(lèi)模型結(jié)合了特異性腫瘤病人形成發(fā)生發(fā)展過(guò)程中腫瘤細(xì)胞本身和細(xì)胞外的特征。預(yù)測(cè)這些新一代的GEM模型和基于GEM模型的移植模型，將是真實(shí)模擬病人腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程，研究自發(fā)性轉(zhuǎn)移疾病的最佳模式動(dòng)物。這些模型可作為研究腫瘤形成的復(fù)雜過(guò)程（包括腫瘤的起始，器官特異性轉(zhuǎn)移的形成，腫瘤微環(huán)境的參與等方面）的重要而有用工具。但是，對(duì)于腫瘤病人而言，更加重要的是，這些模型能更為深入地揭示免疫治療中的反應(yīng)性與耐受性，以及疾病的復(fù)發(fā)等相關(guān)機(jī)制。期待未來(lái)，應(yīng)用新一代GEM模型對(duì)抗腫瘤新藥物臨床前的評(píng)估研究，將會(huì)增加預(yù)測(cè)其在臨床試驗(yàn)中的成功率，從而加速抗腫瘤新藥策略設(shè)計(jì)與臨床實(shí)施，達(dá)到改善防治腫瘤病人的病情的最終目的。

作者簡(jiǎn)介

俞曉峰博士，國(guó)際知名模式動(dòng)物和細(xì)胞生物學(xué)專(zhuān)家，先后就任于耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院、iTL基因打靶公司和紐約大學(xué)醫(yī)學(xué)院以及美國(guó)ASC生物技術(shù)公司等機(jī)構(gòu)，在遺傳修飾模式動(dòng)物領(lǐng)域有超過(guò)20年的研發(fā)和管理經(jīng)驗(yàn)。目前任職于賽業(yè)生物科技，任高級(jí)副總裁和高級(jí)科學(xué)家，主要負(fù)責(zé)基因修飾模式動(dòng)物平臺(tái)的技術(shù)工作，其研究成果多次發(fā)表在Nat Immunol、Mol Cell Biol等高水平雜志上。

 

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