IHC原理、操作及注意事項(xiàng)
免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry，IHC）是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對其進(jìn)行定位、定性及定量的一項(xiàng)技術(shù)。
IHC的實(shí)驗(yàn)流程和方法總體不難，但做出漂亮的染色結(jié)果卻不容易，所謂“細(xì)節(jié)決定成敗”，也正是IHC實(shí)驗(yàn)中尤為重要的關(guān)鍵點(diǎn)。那么“細(xì)節(jié)”主要是哪一些呢？下面就為您一一道來。（以石蠟組織切片為例介紹）
1. 標(biāo)本固定
固定的目的除了使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固，減少或終止內(nèi)源性或外源性細(xì)胞內(nèi)分解酶的反應(yīng)，防止組織細(xì)胞自溶，更是為了保存組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原性，使抗原不失活，不發(fā)生彌散。不同的抗原對固定液耐受程度不同，因而要選擇合適的固定劑。
現(xiàn)在常用的固定劑有中性甲醛液，4%多聚甲醛-磷酸鹽緩沖液。有些固定劑對特殊組織有更好效果，如苦味酸對于頭皮、指甲固定有軟化效果，Helly固定液對于胰島和垂體效果較好，PLP固定液對于含糖組織抗原保存更好。
2. 脫水、石蠟包埋和制片
脫水用梯度乙醇(由低到高)充分脫水，對于一些易脆的組織（如肝、脾等）應(yīng)減少高濃度酒精里的停留時(shí)間，透明的時(shí)間也應(yīng)該控制縮短。對組織浸蠟時(shí)，一般選用56℃~58℃熔點(diǎn)的石蠟，浸蠟溫度最好不超過60℃，防止抗原的損失。包埋時(shí)應(yīng)選好角度動(dòng)作迅速，以便切片時(shí)有完整的切面。切片時(shí)則要該快則快該慢則慢，及時(shí)檢查刀片是否出現(xiàn)缺口，防止蠟帶出現(xiàn)劃痕。
3. 脫蠟和水化
使組織恢復(fù)到固定后的正常狀態(tài)暴露出抗原以方便與一抗結(jié)合。若脫蠟和水化不全易出現(xiàn)局灶性反應(yīng)和浸洗不全，而產(chǎn)生非特異性背景著色。
4. 抗原修復(fù)
由于組織在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而掩蓋抗原決定簇。通過抗原修復(fù)，使得細(xì)胞內(nèi)抗原決定族重新暴露，提高抗原檢測率。常用的修復(fù)方法從強(qiáng)到弱一般分為三種，高壓加熱修復(fù)、微波修復(fù)、胰酶修復(fù)。其中高壓加熱修復(fù)這一方法簡便易操作，效果也更好。使用高壓加熱修復(fù)對于修復(fù)溫度和時(shí)間的把握十分重要，溫度越高修復(fù)時(shí)間越短，溫度與修復(fù)時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。修復(fù)結(jié)束后注意室溫冷卻，讓蛋白自然復(fù)性。其次，盡量使用過量的抗原修復(fù)液，防止高溫液體揮發(fā)干涸，對切片造成不可逆的損傷。
5. 滅活內(nèi)源性過氧化物酶和生物素
在傳統(tǒng)的ABC法和SP法中，免疫組化反應(yīng)容易受到內(nèi)源性過氧化物酶和生物素的干擾，必須用過氧化氫和卵白素等進(jìn)行滅活和封閉。滅活內(nèi)源性過氧化物酶一般用3%過氧化氫滅活約10 min左右，用甲醇配制過氧化氫更適合于保護(hù)抗原和固定組織。
6. 血清封閉
為了防止一抗與組織的非特異性結(jié)合，造成假陽性，一般會(huì)采用BSA、羊血清等封閉這些位點(diǎn)，封閉血清一般是和二抗同一動(dòng)物來源的，室溫封閉10-30 min。
7. 一抗和二抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間
不同的一抗?jié)舛�，孵育時(shí)間和溫度等對染色結(jié)果往往有著較大的影響。在4 ℃下，反應(yīng)緩慢，背景較淺；而37 ℃反應(yīng)較快，時(shí)間較短；室溫介于前兩者之間，選擇室溫孵育有助于實(shí)驗(yàn)流程的便利，同時(shí)也適用于較多樣本的檢測。二抗一般室溫孵育30 min。
8. 切片清洗(浸洗、沖洗和漂洗)
為了防止一抗、二抗等殘留而引起非特異性染色，適當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)清洗尤其重要，建議使用洗瓶沖洗 30 s X 3 次，而一抗孵育后可用TBST單獨(dú)清洗。清洗中要注意單獨(dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染，同時(shí)溫和沖洗，防止脫片。TBS的pH和離子濃度建議用為7.6-8.0，濃度是0.01 M。中性及弱堿性條件有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強(qiáng)度則有利于分解。
9. DAB顯色
背景的深淺和特異性染色的深淺都可以由DAB孵育條件決定。DAB顯色時(shí)間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時(shí)間，到出現(xiàn)特異性染色較強(qiáng)而背景著色較淺時(shí)即可沖洗。DAB顯色時(shí)間很短(如幾秒或幾十秒)就出現(xiàn)很深的棕褐色，這很可能說明一抗?jié)舛冗^高，需要下調(diào)抗體濃度；若很短時(shí)間就出現(xiàn)深背景，有可能非特異性蛋白封閉不全，需要延長封閉時(shí)間；DAB顯色時(shí)間很長(如超過十分鐘)才出現(xiàn)陽性染色，可能是一抗體濃度過低或者封閉時(shí)間過長。對于較弱的DAB顏色有時(shí)可以采取增強(qiáng)方法。如加入金屬離子：硫酸銅、六亞甲基胺銀、氯化鈷、硫酸鎳銨、氯化鎳及咪唑等。
10. 復(fù)染
免疫組化染色后必須進(jìn)行復(fù)染，以襯托出組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。目前常用Mayer's蘇木素復(fù)染，一般2 min分鐘左右，DAB在核蛋白著色則可適當(dāng)縮短復(fù)染時(shí)間，然后氨水或 pH 8.0的TBS返藍(lán)。
11. 封片
為了持久保存，通常會(huì)使用中性樹膠等封片。封片過程中注意斜靠蓋玻片防止氣泡產(chǎn)生影響觀察。如果樹膠較粘稠可以加入適量二甲苯稀釋，使樹膠在封片中能夠快速擴(kuò)散開。在脫水過后建議采取濕封，即組織上還殘留二甲苯時(shí)進(jìn)行封片，同時(shí)注意在通風(fēng)廚中操作。這樣有助于氣泡排除干凈，不影響后續(xù)鏡檢。
1. 標(biāo)本固定
固定的目的除了使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固，減少或終止內(nèi)源性或外源性細(xì)胞內(nèi)分解酶的反應(yīng)，防止組織細(xì)胞自溶，更是為了保存組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原性，使抗原不失活，不發(fā)生彌散。不同的抗原對固定液耐受程度不同，因而要選擇合適的固定劑。
現(xiàn)在常用的固定劑有中性甲醛液，4%多聚甲醛-磷酸鹽緩沖液。有些固定劑對特殊組織有更好效果，如苦味酸對于頭皮、指甲固定有軟化效果，Helly固定液對于胰島和垂體效果較好，PLP固定液對于含糖組織抗原保存更好。
2. 脫水、石蠟包埋和制片
脫水用梯度乙醇(由低到高)充分脫水，對于一些易脆的組織（如肝、脾等）應(yīng)減少高濃度酒精里的停留時(shí)間，透明的時(shí)間也應(yīng)該控制縮短。對組織浸蠟時(shí)，一般選用56℃~58℃熔點(diǎn)的石蠟，浸蠟溫度最好不超過60℃，防止抗原的損失。包埋時(shí)應(yīng)選好角度動(dòng)作迅速，以便切片時(shí)有完整的切面。切片時(shí)則要該快則快該慢則慢，及時(shí)檢查刀片是否出現(xiàn)缺口，防止蠟帶出現(xiàn)劃痕。
3. 脫蠟和水化
使組織恢復(fù)到固定后的正常狀態(tài)暴露出抗原以方便與一抗結(jié)合。若脫蠟和水化不全易出現(xiàn)局灶性反應(yīng)和浸洗不全，而產(chǎn)生非特異性背景著色。
4. 抗原修復(fù)
由于組織在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而掩蓋抗原決定簇。通過抗原修復(fù)，使得細(xì)胞內(nèi)抗原決定族重新暴露，提高抗原檢測率。常用的修復(fù)方法從強(qiáng)到弱一般分為三種，高壓加熱修復(fù)、微波修復(fù)、胰酶修復(fù)。其中高壓加熱修復(fù)這一方法簡便易操作，效果也更好。使用高壓加熱修復(fù)對于修復(fù)溫度和時(shí)間的把握十分重要，溫度越高修復(fù)時(shí)間越短，溫度與修復(fù)時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。修復(fù)結(jié)束后注意室溫冷卻，讓蛋白自然復(fù)性。其次，盡量使用過量的抗原修復(fù)液，防止高溫液體揮發(fā)干涸，對切片造成不可逆的損傷。
5. 滅活內(nèi)源性過氧化物酶和生物素
在傳統(tǒng)的ABC法和SP法中，免疫組化反應(yīng)容易受到內(nèi)源性過氧化物酶和生物素的干擾，必須用過氧化氫和卵白素等進(jìn)行滅活和封閉。滅活內(nèi)源性過氧化物酶一般用3%過氧化氫滅活約10 min左右，用甲醇配制過氧化氫更適合于保護(hù)抗原和固定組織。
6. 血清封閉
為了防止一抗與組織的非特異性結(jié)合，造成假陽性，一般會(huì)采用BSA、羊血清等封閉這些位點(diǎn)，封閉血清一般是和二抗同一動(dòng)物來源的，室溫封閉10-30 min。
7. 一抗和二抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間
不同的一抗?jié)舛�，孵育時(shí)間和溫度等對染色結(jié)果往往有著較大的影響。在4 ℃下，反應(yīng)緩慢，背景較淺；而37 ℃反應(yīng)較快，時(shí)間較短；室溫介于前兩者之間，選擇室溫孵育有助于實(shí)驗(yàn)流程的便利，同時(shí)也適用于較多樣本的檢測。二抗一般室溫孵育30 min。
8. 切片清洗(浸洗、沖洗和漂洗)
為了防止一抗、二抗等殘留而引起非特異性染色，適當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)清洗尤其重要，建議使用洗瓶沖洗 30 s X 3 次，而一抗孵育后可用TBST單獨(dú)清洗。清洗中要注意單獨(dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染，同時(shí)溫和沖洗，防止脫片。TBS的pH和離子濃度建議用為7.6-8.0，濃度是0.01 M。中性及弱堿性條件有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強(qiáng)度則有利于分解。
9. DAB顯色
背景的深淺和特異性染色的深淺都可以由DAB孵育條件決定。DAB顯色時(shí)間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時(shí)間，到出現(xiàn)特異性染色較強(qiáng)而背景著色較淺時(shí)即可沖洗。DAB顯色時(shí)間很短(如幾秒或幾十秒)就出現(xiàn)很深的棕褐色，這很可能說明一抗?jié)舛冗^高，需要下調(diào)抗體濃度；若很短時(shí)間就出現(xiàn)深背景，有可能非特異性蛋白封閉不全，需要延長封閉時(shí)間；DAB顯色時(shí)間很長(如超過十分鐘)才出現(xiàn)陽性染色，可能是一抗體濃度過低或者封閉時(shí)間過長。對于較弱的DAB顏色有時(shí)可以采取增強(qiáng)方法。如加入金屬離子：硫酸銅、六亞甲基胺銀、氯化鈷、硫酸鎳銨、氯化鎳及咪唑等。
10. 復(fù)染
免疫組化染色后必須進(jìn)行復(fù)染，以襯托出組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。目前常用Mayer's蘇木素復(fù)染，一般2 min分鐘左右，DAB在核蛋白著色則可適當(dāng)縮短復(fù)染時(shí)間，然后氨水或 pH 8.0的TBS返藍(lán)。
11. 封片
為了持久保存，通常會(huì)使用中性樹膠等封片。封片過程中注意斜靠蓋玻片防止氣泡產(chǎn)生影響觀察。如果樹膠較粘稠可以加入適量二甲苯稀釋，使樹膠在封片中能夠快速擴(kuò)散開。在脫水過后建議采取濕封，即組織上還殘留二甲苯時(shí)進(jìn)行封片，同時(shí)注意在通風(fēng)廚中操作。這樣有助于氣泡排除干凈，不影響后續(xù)鏡檢。
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