儀器、設(shè)備：

    移液器、免疫組化筆、微波爐或高壓鍋、計(jì)時器、孵育濕盒、染色架、蓋玻片、光學(xué)顯微鏡、洗瓶等。

溶液配制：

    PBS溶液配制；EDTA組織抗原修復(fù)液及DAB顯色液使用詳見免疫組化試劑盒產(chǎn)品說明書操作步驟。

實(shí)驗(yàn)溫度：15-28℃

實(shí)驗(yàn)步驟：

1. 脫蠟水化

    1) 石蠟切片置于新鮮的二甲苯中，浸泡15 min × 2次；

    2) 去除多余的液體后，置無水乙醇中，浸泡3 min × 2次；

    3) 去除多余的液體后，置95%乙醇中，浸泡3 min；

    4) 去除多余的液體后，置85%乙醇中，浸泡3 min；

    5) 自來水沖洗1 min；

    6) PBS溶液沖洗3 min × 3次。

2. 加熱EDTA抗原修復(fù)液（試劑1，采用微波進(jìn)行抗原修復(fù)）

    1) 將脫蠟水化后的組織切片置于燒杯（或修復(fù)盒）中的耐高溫塑料切片架上；

    2) 加適量的修復(fù)液1x EDTA抗原修復(fù)液，（溶液1，用純凈水稀釋20倍后）于燒杯中，液面要浸過切片組織一定高度；

    3) 微波爐先用高檔加熱使液體沸騰，當(dāng)加熱至沸騰時調(diào)到中檔，此時開始計(jì)時，修復(fù)時間一般為20 min，此過程中勿使組織干片（修復(fù)液要足量）；

    4) 將燒杯從微波爐中拿出，放入冷水中冷卻降溫；

    5) 當(dāng)修復(fù)液降至室溫后取出玻片，用PBS（PH7.4）沖洗3 min × 3次。

    注意：

    抗原修復(fù)時，修復(fù)液務(wù)必保證切片始終浸泡在液體內(nèi)，一般情況：修復(fù)液的量為800 mL/1架-1500 mL/3架；

    取出玻片，用PBS沖洗時，切勿對著組織沖洗，以免弄破組織。

3. 阻斷內(nèi)源性過氧化物酶

    1) 用吸水紙擦干玻片，免疫組畫筆在組織周圍畫圈；

    2) 將3%的過氧化氫（試劑2），滴加100 μL到切片組織上以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，室溫孵育15 min；

    3) PBS沖洗3 min × 3次。

4. 封閉

    用吸水紙擦干玻片，滴加正常山羊血清（試劑3），室溫封閉15 min，以減少非特異性染色。

5. 一抗孵育

    1) 用吸水紙擦干玻片組織周圍的液體；

    2) 滴加單克隆抗體（試劑4）100 μL，如果做陰性對照實(shí)驗(yàn)，就在對照組的組織上滴加PBS作為陰性對照，置于濕盒中室溫孵育1h或4°C孵育過夜。

6. 復(fù)溫

    1) 樣本4℃過夜從冰箱拿出后需在室溫下孵育15 min復(fù)溫（抗體孵育為4℃過夜選用此步驟，如室溫孵育直接進(jìn)入下一步清洗）；

    2) PBS沖洗3 min × 3次。

7. 加聚合物輔助劑（試劑5）

    1) 吸水紙擦干切片后滴加試劑5（Polymer Helper），室溫或37℃孵育20 min；

    2) PBS沖洗3 min ×3次。

8. 二抗孵育

    1) 吸水紙擦干切片后滴加試劑6（Polyperoxidase-anti-mouse/rabbit IgG），室溫或37℃孵育20 min；

    2) PBS沖洗3 min × 4次。

9. 顯色

    1) 甩去PBS液，吸水紙擦干切片；

    2) 每張切片滴加新鮮配制的DAB顯色液100 μL（試劑7：試劑8=1:49比例配置），孵育3-5 min，光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果，切勿顯色過深；

    3) 顯色后用自來水沖洗切片終止顯色。

10. 復(fù)染

    加100 μL的蘇木素（試劑9）復(fù)染，孵育30 s-1 min左右，自來水沖洗5 min。

    注意：

    依據(jù)作用的蘇木素染色液強(qiáng)度和孵育時間長短，對比染色結(jié)果導(dǎo)致細(xì)胞核呈現(xiàn)淡藍(lán)到深藍(lán)顏色的反應(yīng)，而過染或者不足都可能影響正確結(jié)果的判斷。

11. 脫水、透明、封片

    1) 將切片放入70%酒精，浸泡2 min；

    2) 將切片放入80%酒精，浸泡2 min；

    3) 將切片放入90%酒精，浸泡2 min；

    4) 將切片放入95%酒精，浸泡2 min；

    5) 將切片放入無水乙醇，浸泡2 min × 2次；

    6) 將切片放入二甲苯，浸泡2min × 2次；

    7) 通風(fēng)櫥中風(fēng)干切片；

    8) 滴加中性樹膠，蓋玻片封片。

結(jié)果判斷：
1. 免疫組化檢測結(jié)果需在光學(xué)顯微鏡下對染色后的切片進(jìn)行觀察并判斷。

    免疫組化染色結(jié)果必須建立在組織陽性對照、試劑陰性對照試驗(yàn)成立的基礎(chǔ)上，染色結(jié)果的判讀：陽性（+）/陰性（—）。

陰性染色結(jié)果是組織內(nèi)預(yù)期細(xì)胞中未見棕黃色著色。

    注意：在每一次染色過程中，必須使用陽性對照樣本和空白對照試驗(yàn)，否則結(jié)果不可采用。

2. 組織陽性對照和試劑陰性對照試驗(yàn)成立的基礎(chǔ)上，受檢組織切片中出現(xiàn)陽性染色表示組織切片上存有目的抗原。

3. 組織陽性對照和試劑陰性對照試驗(yàn)成立的基礎(chǔ)上，受檢組織切片中未出現(xiàn)陽性染色表示組織切片上存有目的抗原的可能性低。

4. 如果組織陽性對照和試劑陰性對照試驗(yàn)均為陰性結(jié)果，表明試劑失效或試驗(yàn)操作錯誤，應(yīng)重新實(shí)驗(yàn)。