全世界各個科研大國的腦計劃，起因于人們對行為及大腦探秘的高度關(guān)注。Nature不久前的一篇報道闡述到，中國腦科學(xué)研究所于2018年3月22日正式在北京成立，中國腦計劃實體店終開，北京大學(xué)饒毅與NIBS北京生命科學(xué)研究所羅敏敏共同主管。此舉也是繼2013年歐美的腦計劃、日本2014年的類似小的項目、韓國2016年后中國的跟進(jìn)。北京市政府資助1.8億人民幣，五年內(nèi)招募約5-6個課題組約50名研究者，之后希望借助腦計劃每年大約需4億人民幣。不難看出，對大腦的研究是一個極其重要而艱難的任務(wù)，任重道遠(yuǎn)，需要相關(guān)領(lǐng)域科研工作者貢獻(xiàn)自己的才智、見識與勤勉。本文接下來是對學(xué)習(xí)與記憶機制研究的相關(guān)文章進(jìn)行解讀與闡釋。

 

TRPM7在不同發(fā)育階段對維持正常突觸密度以及學(xué)習(xí)記憶是必不可少的

在復(fù)旦大學(xué)腦科學(xué)研究院、醫(yī)學(xué)神經(jīng)生物學(xué)國家重點實驗室研究員那德（Nashat Abumaria）課題組的努力下，其研究成果發(fā)表在Cell Reports的封面上，影響因子IF為8.032，鑒于榮登封面，價值高于影響因子。

文章關(guān)注的是一種通道酶TRPM7，因為它在很多組織都有，這里關(guān)注的是它在CNS中樞神經(jīng)系統(tǒng)并且是生理情況下非病理情況下的功能與角色,確切的是海馬區(qū)的神經(jīng)元Knockdown敲低以后發(fā)現(xiàn)突觸密度減少，但這一現(xiàn)象可以通過C端激酶區(qū)得到挽救，挽救的機制可能是磷酸化下游的cofilin蛋白(Cofilin是普遍存在于真核細(xì)胞的一種肌動蛋白結(jié)合蛋白.Cofilin的基本功能是在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合和解聚F肌動蛋白)；出生后小鼠knockout敲除以后損傷了學(xué)習(xí)記憶以及減少了突觸密度以及突觸可塑性，成年大鼠海馬區(qū)knockdown以后也損傷了學(xué)習(xí)記憶以及減少了突觸密度以及突觸可塑性；

 

 

為了研究這個通道酶對學(xué)習(xí)與記憶的影響，文章選取了小鼠與大鼠這兩種模式動物，為了細(xì)致觀察這種通道酶的功能，做了Knockdown敲低（針對成年大鼠）以及Knockout敲除（針對出生后小鼠）這兩種處理方式，輔以挽救實驗即在Knockout敲除的小鼠大腦內(nèi)又注射回該酶以觀察效果（針對小鼠，并針對該酶的部分區(qū)域即激酶區(qū)域），對于主要的衡量指標(biāo)包括突觸密度、突觸可塑性以及學(xué)習(xí)與記憶行為，前兩種的衡量方法屬于比較常規(guī)的抗體染色顯微成像、體外電生理記錄，后一種課題組采用了荷蘭諾達(dá)思全新的Cognition Wall認(rèn)知墻工具評判學(xué)習(xí)與記憶行為，值得關(guān)注。后面會具體談到。

 

1、體外細(xì)胞層面

首先體外情況如何，在細(xì)胞層面，Knockdown敲低TRPM7的表達(dá)，看看海馬體神經(jīng)元的情況，當(dāng)然敲除后表達(dá)量減少了并且不影響其它蛋白的表達(dá)并且不影響神經(jīng)元的生長，另外關(guān)鍵的發(fā)現(xiàn)突觸密度顯著減少，突觸素等也顯著下降! 

 

上圖左邊是對照組，右邊是敲低后的實驗組，可以看出各種重要染色顯示敲低后突觸密度、突觸素顯著下降。上面的諸多敲低后的結(jié)果到底是什么在起作用，于是展開挽救實驗，提高鎂離子和鋅離子濃度，不行，甚至發(fā)現(xiàn)后來兩者的細(xì)胞內(nèi)濃度與TRPM7無關(guān)了，看來非離子通道在突觸密度減少起作用；后來加入C端激酶區(qū)域，發(fā)現(xiàn)突觸密度顯著提高！

 

上面六張熒光圖，第二張即是加入C端激酶區(qū)域，發(fā)現(xiàn)突觸密度顯著提高，而第三張是突變了的C端激酶發(fā)現(xiàn)就不能提高，其特異性可見！

 

2、動物模型層面

進(jìn)入到小鼠與大鼠的動物階段！

采用特定knockout的小鼠，大腦特定區(qū)域基因敲除了TRPM7看看實際的個體層面的情況，檢查一些基本的行為參數(shù)比如運動活性、探索新物體的動機，這些都是正常的。新物體識別的認(rèn)知參數(shù)，敲掉后小鼠明顯下降。學(xué)習(xí)認(rèn)知實驗中，敲除后的小鼠明顯學(xué)習(xí)能力下降，只有40%的小鼠學(xué)會了認(rèn)知墻實驗，學(xué)習(xí)階段獲取了更少的顆粒獎勵，記憶階段更少地做出了正確的選擇。而且CA1區(qū)域(海馬體的一個區(qū)域)的突觸密度也顯著下降。并且突觸前末端密度減少、突觸后場興奮電位下降，這些都表明基因敲除的小鼠突觸的可塑性受損了。

 

圖1：

 

圖2：

圖1左邊是黑色的是對照組的突觸密度，右邊黑色的是敲除組的突觸密度，明顯下降！圖2測定的是場興奮性突觸后電位，黑色的是對照組的LTP長時程增強，紅色的是敲除組的LTP長時程增強，明顯突出的可塑性受損！

這些突觸密度的下降、突觸可塑性的受損，反應(yīng)到行為學(xué)上則是學(xué)習(xí)認(rèn)知的問題。

 

采用荷蘭諾達(dá)思的Cognition Wall認(rèn)知墻工具進(jìn)行學(xué)習(xí)認(rèn)知行為的研究  

 

Cognition Wall認(rèn)知墻工具包含EthoVision軟件系統(tǒng)以及PhenoTyper小鼠家居箱以及三孔認(rèn)知墻等。動物從特定的入口進(jìn)入（上圖顯示綠色的入口），則軟件自動給予食物獎勵（上圖藍(lán)色的顆粒顯示）該實驗全程自動，不需要人為干預(yù)，軟件自動控制硬件并自動記錄數(shù)據(jù)并自動分析數(shù)據(jù)。

 

實驗如下：

• 實驗前一周小鼠在標(biāo)準(zhǔn)的鼠籠單籠飼養(yǎng)；
• 實驗開始前11個小時前將小鼠放入小鼠家居箱，讓其適應(yīng)環(huán)境，即大約晚上8:30將小鼠放入，可以進(jìn)水限制進(jìn)食；
• 這個適應(yīng)階段放入10粒食物，使小鼠能找到食物給予的地方
• 早上7:30放入認(rèn)知墻，早上8:00開始實驗，全程自動進(jìn)行；
• 這個過程小鼠需要連續(xù)進(jìn)入左邊的孔5次則軟件自動控制硬件給予一粒食物（即上圖綠色的孔）。

 

Tip:本文的小鼠節(jié)律是晚上8點開燈至第二天早上8點關(guān)燈，后期采用紅色昏暗的燈光作為晚上時間，即light phase 8:00pm-8:00am dark phase 8:00am-8:00pm其中dark phase為實驗進(jìn)行時段。

以下圖示為實驗結(jié)果：

從從結(jié)果可以看出，基因敲除的紅色線的小鼠只有40%的學(xué)會了認(rèn)知墻！對照組全部學(xué)會！對比明顯！

在一天后的記憶測試階段，將小鼠重新放回帶有認(rèn)知墻的家居箱，在1個小時的測試中計算小鼠做出正確選擇的比例（即從左邊孔進(jìn)入）。

 

從結(jié)果可以看出，基因敲除的紅色線的小鼠做出正確選擇的比例明顯低于對照組。

 

為了確保食物獎勵的裝置沒有問題，實驗者亦手動數(shù)了每只小鼠在學(xué)習(xí)過程中獲得的食物獎勵的數(shù)目，因為食物獎勵的數(shù)目與小鼠的學(xué)習(xí)能力是相關(guān)的。

 

明顯，基因敲除的小鼠獲取食物獎勵的數(shù)目少于對照組，學(xué)習(xí)能力明顯弱于對照組。

沒有完！在小鼠模型上注射C端激酶的病毒進(jìn)行挽救實驗，對照組、激酶組、突變激酶組，一個月后做行為學(xué)測試后處死進(jìn)一步分析，新物體識別的認(rèn)知參數(shù)，對照組和激酶組都明顯高于突變激酶組。學(xué)習(xí)認(rèn)知實驗中，對照組和激酶組都明顯學(xué)習(xí)得更快，記憶測試也更多地做出了正確的選擇。當(dāng)然突觸密度與突觸可塑性均高于突變組。

 

 

這和最開始的細(xì)胞實驗對應(yīng)了起來，在動物模型上并且是行為實驗上驗證了C端激酶對學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵作用。

 

當(dāng)然以大鼠為模型，在特定knockdown的大鼠，確定敲低其表達(dá)以后，同樣基本的行為參數(shù)是沒有差異的，后測定大鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力，T迷宮空間學(xué)習(xí)實驗（敲低后做出正確選擇的比例明顯下降）、短期再認(rèn)記憶（過去經(jīng)驗或識記過的事物再次呈現(xiàn)在面前時仍能確認(rèn)和辨認(rèn)出來的過程）也受損、背景記憶也受損，當(dāng)然突觸密度與突觸可塑性均明顯下降 。

 

 

最后一個話題，文獻(xiàn)報道過cofilin參與的一些功能和TRPM7敲除后很類似，提出假設(shè)在學(xué)習(xí)認(rèn)知層面TRPM7可能借助cofilin參與了下游的機制，發(fā)現(xiàn)敲除后cofilin磷酸化（抑制）顯著減少，而激酶組的cofilin確實磷酸化得到了恢復(fù)，并驗證了兩者是直接結(jié)合的。

當(dāng)然下游這塊研究還是比較簡單，偏向于現(xiàn)象的關(guān)聯(lián)，未能直接與學(xué)習(xí)記憶做深入研究。另外，激酶的功能是通過突觸前、突觸后來調(diào)控突觸密度的機制也需要進(jìn)一步闡明。

 

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參考文獻(xiàn)：

Liu YQ#,Chen C# ,Liu YL#,Li W, Wang ZH,Sun QF,Zhou H,Chen XJ,Yu YC,Wang Y, Nashat Abumaria*. (2018) TRPM7 Is Required for Normal Synapse Density, Learning, and Memory at Different Developmental Stages .Cell Reports.23(12):3480–3491