關(guān)鍵詞

煙草；有機(jī)磷農(nóng)殘；大體積不分流； GC-FPD

摘要

本文采用 GC-FPD 結(jié)合大體積不分流進(jìn)樣技術(shù)，建立高效、靈敏測(cè)定煙草中有機(jī)磷農(nóng)殘的檢測(cè)方法。對(duì)煙草樣品，采用改進(jìn)的 QuEChERS 方法，以去離子水浸泡、乙酸乙酯丙酮混合溶劑對(duì)煙草中的有機(jī)磷農(nóng)殘進(jìn)行提取，經(jīng)Carbon-NH2 復(fù)合柱凈化，不經(jīng)濃縮直接進(jìn)樣分析。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)： 1）使用大體積不分流進(jìn)樣技術(shù)，進(jìn)樣體積為 30ul 時(shí)，對(duì)各有機(jī)磷農(nóng)殘的檢測(cè)相比傳統(tǒng)不分流進(jìn)樣 1ul，靈敏度提高了近 25 倍； 2）采用經(jīng) Carbon-NH2 復(fù)合柱凈化后的空白煙草提取液配制的有機(jī)磷農(nóng)殘系列標(biāo)樣能顯著改善各有機(jī)磷的峰形以及靈敏度�？傮w來(lái)看，采用 GC-FPD 結(jié)合大體積不分流進(jìn)樣技術(shù)對(duì)煙草中有機(jī)磷農(nóng)殘檢測(cè)是一種非常靈敏、高效的檢測(cè)方法，能夠大大減少前處理過(guò)程中對(duì)樣品濃縮的時(shí)間耗費(fèi)，并同時(shí)具有較高的檢測(cè)靈敏度。

1. 簡(jiǎn)介

隨著科技的發(fā)展以及人們對(duì)健康的不斷關(guān)注，關(guān)于食品、消費(fèi)品以及環(huán)境等各方面的農(nóng)藥殘留， 對(duì)其的檢測(cè)日趨受到越來(lái)越多的國(guó)家和檢測(cè)機(jī)構(gòu)的重視 [1]。 隨著中國(guó)加入 WTO 和國(guó)際煙草控制公約， 國(guó)際上對(duì)卷煙和煙葉中的農(nóng)殘最高限量均做出了規(guī)定 [2]； 另外， 少量殘留在煙草中的農(nóng)藥， 特別是有機(jī)磷農(nóng)殘因其高的毒性， 在卷煙抽吸時(shí)會(huì)直接影響吸煙者的身體健康， 所以建立有效、 可行的檢測(cè)方法來(lái)測(cè)定煙草中有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留量是十分必要的。

目前，國(guó)內(nèi)外針對(duì)煙草中有機(jī)磷農(nóng)殘的檢測(cè)方法很多，主要有GC-FPD、GC-MS以及GC-MS/MS方法等[2-4]。其中，GC-FPD方法因其配制簡(jiǎn)單、對(duì)有機(jī)磷檢測(cè)具有高選擇性、可大大降低復(fù)雜基質(zhì)中的干擾問(wèn)題，而受到許多檢測(cè)機(jī)構(gòu)的廣泛采用。在煙草有機(jī)磷農(nóng)殘前處理方面，QuEChERS 方法作為一種快速、 簡(jiǎn)便、 價(jià)格低廉、 適用面（包括農(nóng)藥種類和基質(zhì)種類）廣的樣品前處理方法，其低成本高效的樣品處理技術(shù)，可用于絕大多數(shù)食品基質(zhì)的寬泛的農(nóng)藥殘留類別，已被多個(gè)國(guó)際農(nóng)藥殘留分析機(jī)構(gòu)廣泛采納。但是，樣品中大多有機(jī)磷農(nóng)殘的濃度低，為了達(dá)到對(duì)其的準(zhǔn)確測(cè)定，通常需要對(duì)其進(jìn)行濃縮，以提高目標(biāo)物濃度，而在此過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致部分低沸點(diǎn)的有機(jī)磷農(nóng)殘的揮發(fā)損失，從而影響對(duì)其的準(zhǔn)確定量；且此過(guò)程耗時(shí)，不利于檢測(cè)效率的提高。對(duì)此，可采用大體積進(jìn)樣技術(shù)，通過(guò)提高樣品的進(jìn)樣量來(lái)提高對(duì)有機(jī)磷農(nóng)殘檢測(cè)的靈敏度，不進(jìn)行樣品濃縮，而達(dá)到與傳統(tǒng)進(jìn)樣方式需要濃縮樣品測(cè)定有機(jī)磷農(nóng)殘時(shí)相同的靈敏度，從而簡(jiǎn)化樣品前處理步驟。程序升溫大體積進(jìn)樣技術(shù)，是目前應(yīng)用最多的一種大體積進(jìn)樣技術(shù)，它可以在略高于溶劑沸點(diǎn)的溫度下通過(guò)載氣將溶劑分流出襯管，然后快速升溫將目標(biāo)物汽化轉(zhuǎn)移到色譜柱進(jìn)行分離[5]。在這一過(guò)程中，對(duì)于一些低沸點(diǎn)的農(nóng)殘會(huì)隨著溶劑的分流而損失，并最終導(dǎo)致其檢測(cè)靈敏度低的結(jié)果。為了克服這一問(wèn)題，另一種大體積進(jìn)樣技術(shù) --- 同時(shí)溶劑濃縮進(jìn)樣技術(shù)（SCR）通過(guò)預(yù)柱來(lái)承載大體積進(jìn)樣的所有溶劑及目標(biāo)物， 然后緩慢蒸發(fā)溶劑通過(guò)色譜柱到達(dá)檢測(cè)器并放空， 比溶劑沸點(diǎn)略高的目標(biāo)物在溶劑之后達(dá)到檢測(cè)器被檢測(cè)， 從而保證了所有沸程的目標(biāo)組分均由色譜柱分離到達(dá)檢測(cè)器，因此可以保證較高的檢測(cè)靈敏度 [6-7]。

鑒于此，本文以改進(jìn)的QuEChERS方法進(jìn)行提取、經(jīng)Carbon-NH2復(fù)合柱凈化、采用GC-FPD結(jié)合大體積不分流進(jìn)樣技術(shù)，不經(jīng)濃縮直接進(jìn)樣來(lái)高效、靈敏地檢測(cè)煙草中的有機(jī)磷農(nóng)殘含量。

2. 實(shí)驗(yàn)材料

2.1 儀器與試劑

2.1.1 儀器

Trace 1310 GC-FPD 氣相色譜儀（Thermo Fisher Scientific）；Triplus RSH 三 合 一 自 動(dòng) 進(jìn) 樣 器（Thermo Scientific）； TR-35MS 色 譜 柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）（Thermo Fisherscientific, P/N： 260C142P）； 大體積不分流套件（內(nèi)含 5mm×0.32 mm 預(yù)柱、 玻璃兩通以及大體積不分流計(jì)算軟件）（Thermo Fisher scientific, P/N:19050725）。

2.1.2 試劑、 耗材

二溴磷、 甲胺磷、 速滅磷、 滅線磷、 甲基內(nèi)吸磷、 特丁硫磷、乙拌磷、 樂(lè)果、 甲基嘧啶磷、 甲基對(duì)硫磷、 馬拉硫磷、殺螟硫磷、 對(duì)硫磷、 溴硫磷標(biāo)樣， 濃度均為 100ppm， 購(gòu)于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心； 氯化鈉、 無(wú)水硫酸鈉購(gòu)于上海國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司； Carbon-NH2 復(fù)合柱（規(guī)格 1g） 購(gòu)于上海安普科技有限責(zé)任公司； 乙酸乙酯（色譜純）、丙酮（色譜純） 由 ThermoFisher 提供； 水為去離子水； 煙草煙絲由市場(chǎng)購(gòu)買（使用前粉碎成煙末）。

2.2 提取溶劑及有機(jī)磷標(biāo)樣的配制

提取溶劑： 取 450ml 乙酸乙酯與 50ml 丙酮混合， 配制成乙酸乙酯與丙酮體積比為 9:1 的混合溶劑。

空白煙草提取液： 取 2.0g 無(wú)待測(cè)有機(jī)磷的煙末， 加入10ml 去離子水浸泡 5min， 加入 4.0g NaCl， 20ml 乙酸乙酯丙酮混合溶劑， 渦旋 2min， 過(guò) Carbon-NH2 復(fù)合柱凈化，待配標(biāo)樣用。

濃度為 1.0ppm 的 14 種有機(jī)磷農(nóng)殘混標(biāo)： 分別取 100ul100ppm 的各有機(jī)磷農(nóng)殘標(biāo)樣儲(chǔ)備液 , 加入到 10ml 容量瓶中 , 用空白煙草提取液定容至刻度， 得到濃度為 1.0ppm的 14 種有機(jī)磷農(nóng)殘混標(biāo)。

系列濃度有機(jī)磷農(nóng)殘標(biāo)樣的配制： 取 5 ml 1.0 ppm 的 14 種種有機(jī)磷農(nóng)殘混標(biāo)加入到 10ml 的溶劑瓶中， 置于 TriplusRSH 三合一自動(dòng)進(jìn)樣品臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)清洗位的 4 號(hào)位； 將 10ml空白煙草提取液加入到 10ml 溶劑瓶中置于 Triplus RSH 三合一自動(dòng)進(jìn)樣品臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)清洗位的 1 號(hào)位， 用做稀釋溶劑；在 Triplus RSH 大體積清洗位上的兩個(gè)溶劑瓶中分別加入適量的乙酸乙酯丙酮混合溶劑用于洗針。 在樣品盤(pán)上放置空樣品瓶（位置如下圖，圖1的2、3、4、5、6號(hào)位），直接調(diào)用內(nèi)置自動(dòng)稀釋文件，即可自動(dòng)配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度分別為20ppb、50ppb、100ppb、200ppb和500ppb）。

2.3 樣品前處理

精確稱取煙末樣品 2.0g 于 50mL 離心管中， 加入 10.0ml 去離子水， 浸泡 5min； 加入 4.0g NaCl 和 20.0ml 的乙酸乙酯丙酮混合溶劑， 渦旋 3min； 取 10ml 乙酸乙酯丙酮混合溶劑活化 Carbon-NH2 復(fù)合柱（在上端加入 2.0g 無(wú)水硫酸鈉），吹干后， 取 10ml 提取液上樣， 過(guò)柱（流速約 1 滴 /s）；裝入色譜瓶， 進(jìn)行 GC-FPD 分析。

2.4 樣品加標(biāo)

精確稱取煙末樣品 2.0g 于 50mL 玻璃瓶中， 加入 10.0ml 去離子水， 浸泡 5min； 分別加入 1.0ml 及 2.0ml 1.0ppm 的 14種有機(jī)磷農(nóng)殘混標(biāo)； 加入 4.0g NaCl 和 19.0ml 及 18.0ml 的乙酸乙酯丙酮混合溶劑， 渦旋 3min； 取 10ml 乙酸乙酯丙酮混合溶劑活化 Carbon-NH2 復(fù)合柱（在上端加入 2.0g 無(wú)水硫酸鈉）， 吹干后， 取 10ml 提取液上樣， 過(guò)柱（流速約 1 滴 /s）； 裝入色譜瓶， 進(jìn)行 GC-FPD 分析。

2.5 色譜條件

色譜條件： 柱溫： 75℃（7 min）， 20℃ /min 到 200℃，10℃ /min 到 280℃（6min）； 不分流進(jìn)樣， 不分流時(shí)間7min； 進(jìn)樣口溫度： 280℃； 載氣： 高純氮（99.999%），恒流模式， 1.2 mL/min。 液體進(jìn)樣模式， 進(jìn)樣量： 30.0 μL，進(jìn)樣速度 100ul/s； FID 檢測(cè)器： 基座溫度 300℃， 檢測(cè)池溫度 150℃， 空氣 115 mL/min， 氫氣 90mL/min。

3. 結(jié)果與討論

3.1 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

3.1.1 大體積不分流進(jìn)樣與標(biāo)準(zhǔn)不分流進(jìn)樣的比較

圖 2 為濃度 100ppb 的 14 種有機(jī)磷農(nóng)殘， 采用大體積不分流進(jìn)樣（進(jìn)樣體積 30ul、 黑色） 和標(biāo)準(zhǔn)不分流進(jìn)樣（進(jìn)樣體積 1ul、 紅色） 的色譜圖。 從圖中可以看出， 采用大體積不分流進(jìn)樣能夠顯著提高各有機(jī)磷農(nóng)殘的靈敏度。 經(jīng)計(jì)算， 采用大體積不分流進(jìn)樣 30ul， 大部分有機(jī)磷農(nóng)殘的峰面積比標(biāo)準(zhǔn)不分流進(jìn)樣 1ul， 平均提高近 25倍（見(jiàn)表 1）。

3.1.2 空白基質(zhì)提取液對(duì)有機(jī)磷峰形及靈敏度的影響

圖 3 為濃度為采用兩種不同溶劑配制的 14 種有機(jī)磷農(nóng)殘標(biāo)樣的色譜圖， 濃度均為 100 ppb， 采用大體積進(jìn)樣， 進(jìn)樣量 30ul。 其中采用以空白煙草提取液配制的標(biāo)樣色譜圖和由乙酸乙酯丙酮混合溶劑配制的標(biāo)樣色譜圖分別以紅色和藍(lán)色標(biāo)記。 從這兩種不同溶劑配制的 14 種有機(jī)磷農(nóng)殘標(biāo)樣的色譜圖可以看出， 以煙草基質(zhì)提取液配制的標(biāo)樣相比于由乙酸乙酯丙酮混合溶劑配制的標(biāo)樣， 各有機(jī)磷的峰形以及靈敏度有了明顯的改善， 特別是甲胺磷、樂(lè)果以及溴硫磷。 上述現(xiàn)象說(shuō)明， 基質(zhì)標(biāo)樣能明顯改善目標(biāo)物特別是有機(jī)磷的峰形以及靈敏度。 鑒于此， 后續(xù)均采用空白煙草基質(zhì)提取液來(lái)配制系列有機(jī)磷農(nóng)殘標(biāo)樣，以消除基質(zhì)效應(yīng)的影響。

3.2 線性以及方法的檢出限

對(duì)于系列有機(jī)磷農(nóng)殘標(biāo)樣， 采用 Triplus RSH 自動(dòng)配標(biāo)曲功能進(jìn)行配制， 各濃度分別為： 20ppb、 50ppb、 100ppb、200ppb 和 500ppb。 采用上述方法分別進(jìn)樣分析， 考察在20ppb-500ppb 濃度范圍內(nèi)的線性 , 計(jì)算得出 14 種有機(jī)磷農(nóng)殘的線性方程及其相關(guān)系數(shù) ; 以 3 倍信噪比計(jì)算其檢出限 , 結(jié)果見(jiàn)表 2。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 在設(shè)定的濃度范圍內(nèi) 14種有機(jī)磷農(nóng)殘?jiān)谠摑舛确秶鷥?nèi)的響應(yīng)與其濃度呈良好的線性關(guān)系 , 相關(guān)系數(shù)均大于 0.998（圖 4） , 且其檢出限均低于 CORESTA 指導(dǎo)性殘留限量 (GRLs)[8]。 這也同時(shí)表明了Triplus RSH 的高準(zhǔn)確配標(biāo)樣功能以及大體積不分流進(jìn)樣的可靠性。

3.3 回收率和重復(fù)性

按照上述方法在不含待測(cè)有機(jī)磷農(nóng)殘的煙葉樣品中加入0. 5 和 1.0 mg/Kg 的 14 種有機(jī)磷農(nóng)殘標(biāo)樣， 分別進(jìn)行前處理和 GC-FPD 分析， 并按照加標(biāo)量和實(shí)際測(cè)定量計(jì)算其回收率， 結(jié)果見(jiàn)表 3。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 在上述 2 個(gè)加標(biāo)水平下， 14 種有機(jī)磷農(nóng)殘除了二溴磷回收率大于 120%， 其它均在 75%-110% 之間， 且平行測(cè)定 6 次的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于 4%， 能夠很好地符合對(duì)農(nóng)藥多殘留檢測(cè)的需求。

總結(jié)

本文采用 Thermo Scientific GC-FPD配合大體積不分流組件，以改進(jìn)的 QuEChERS 方法（去離子水浸泡、 乙酸乙酯丙酮混合溶劑對(duì)煙草中的有機(jī)磷農(nóng)殘進(jìn)行提�。�， 經(jīng) CarbonNH2 復(fù)合柱凈化， 不經(jīng)濃縮直接進(jìn)樣分析。 在進(jìn)樣體積為 30ul 時(shí)， 對(duì)各有機(jī)磷農(nóng)殘的檢測(cè)相比傳統(tǒng)不分流進(jìn)樣1ul， 靈敏度提高了近 25 倍。 該方法的操作步驟簡(jiǎn)單、 穩(wěn)定， 無(wú)需繁瑣、 耗時(shí)的除溶劑步驟， 可以避免揮發(fā)性農(nóng)殘的損失； 對(duì)各有機(jī)磷農(nóng)殘的檢測(cè)限度均低于 CORESTA指導(dǎo)性殘留限量要求。 同時(shí)對(duì)煙草樣品進(jìn)行了 0.5mg/Kg和 1.0mg/Kg 兩個(gè)水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)， 14 種有機(jī)磷農(nóng)殘除了二溴磷回收率大于 120%， 其它均在 75%-110% 之間，能夠很好地符合對(duì)有機(jī)磷農(nóng)殘的日常檢測(cè)需求。

參考文獻(xiàn)

[1] 鄒西梅 , 林竹光 . 煙草和蔬菜水果中多類多種農(nóng)藥殘留的 GC-EI/MS 分析方法研究與應(yīng)用 , 廈門大學(xué)碩士學(xué)位論文， 2009,1-101.
[2] 張洪非， 胡清源， 唐綱嶺， 邊照陽(yáng)， 王芳 . 氣相色譜質(zhì)譜法分析煙草中 29 種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留 , 中國(guó)煙草學(xué)報(bào) ,2008, 14,9-13.
[3] 石杰 , 楊靜 , 劉惠民 , 胡斌 , 陶鵬麗 , 嚴(yán)會(huì)會(huì) . 煙草中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的 GC ／ MS 快速分析 , 煙草科技 ,2010,9,43-46.
[4] XS Chen,ZY Bian,HW Hou,FYang,SS Liu,GL Tang and QY Hu.Development and Validation of a Method for the Determination of 159 Pesticide Residues in Tobacco by Gas ChromatographyTandem Mass Spectrometry, J.Agric.Food Chem.2013,61,5746-5757.
[5] 樓小華 , 高川川 , 朱文靜 , 張洪非 , 唐綱嶺 , 邊照陽(yáng) , 巴金莎 .PTV-GC-MS/MS 同時(shí)測(cè)定煙草中 202 種農(nóng)藥殘留 ,煙草科技 ,2013,8,45-57.
[6] M.Biedermann,A. Fiscalini,K. Grob.Large volume splitless injection with concurrent solvent recondensation: Keeping the sample in place in the hot vaporizing chamber, J. Sep. Sci. 2004,27, 1157–1165
[7] P.Magni,T.Porzano,Concurrent solvent recondensation large sample volume splitless injection, J.Sep.Science (2003) 26,1491-1498.
[8] Mueller L, KrzemienM R. The concep t and implementation of agrochemical guidance residue levels [ S ] / / CORESTA Agrochemical Residual Group. CORESTA Guide No. 1, 2003.