體液還原型谷胱甘肽濃度比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

體液還原型谷胱甘肽（REDUCED GLUTATHIONE）濃度比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在使用Ellman試劑與還原型谷胱甘肽反應(yīng)，產(chǎn)生黃色5-巰基-2-硝基苯甲酸產(chǎn)物，呈現(xiàn)吸光峰值的變化，即采用比色法來(lái)測(cè)定樣品中還原型谷胱甘肽含量的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適用于各種體液包括尿液、腦脊液、唾液、精液等的還原型谷胱甘肽的檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，重復(fù)性好。

技術(shù)背景

谷胱甘肽（glutathione）是一種三肽分子，即γ-谷氨酰半胱胺酰甘氨酸（γ-glutamylcysteinylglycine），也是含有硫醇（Thiol）最為豐富的化合物，廣泛存在于動(dòng)物、植物、細(xì)菌和酵母細(xì)胞中。且90至95％以還原型形式存在。其功能在于1）作為谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的親核性底物（nucleophilic substrate），進(jìn)行外源性化學(xué)物質(zhì)（xenobiotics）的解毒；2）作為谷胱甘肽過(guò)氧化酶的電子供體，還原氫過(guò)氧化物（hydroperoxides）；3）參與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和蛋白硫氫基（sulfhydryls）還原狀態(tài)的維持、以及抗氧化作用等。細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的水平是細(xì)胞健康的敏感指標(biāo)。通過(guò)還原型谷胱甘肽的硫氫基團(tuán)與Ellman試劑5,5-二硫基-雙（2-硝基苯甲酸）[5,5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反應(yīng)后，產(chǎn)生黃色的5-巰基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通過(guò)其吸收峰值的變化（412nm波長(zhǎng)），來(lái)定量分析還原型谷胱甘肽的含量，其反應(yīng)方式為：

產(chǎn)品內(nèi)容

抗干擾液（Reagent A）  毫升

緩沖液（Reagent B）  毫升

底物液（Reagent C）    毫升

標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）  微升

稀釋液（Reagent E）  毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)     1份

保存方式

保存抗干擾液（Reagent A）和緩沖液（Reagent B）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里；底物液（Reagent C）和標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）避免光照；有效保證6月

用戶(hù)自備

1.5毫升離心管：用于樣品和標(biāo)準(zhǔn)品制備的容器

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品處理

恒溫水槽：用于反應(yīng)孵育

96孔板或200微升1厘米光徑比色皿：用于比色的容器

酶標(biāo)儀或分光光度儀：用于樣品比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，設(shè)定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長(zhǎng)412nm，并置零。然后進(jìn)行下列操作。

一、樣品準(zhǔn)備（尿液/腦脊液/唾液/精液樣品）

• 準(zhǔn)備好1.5毫升離心管
• 移取1毫升液體到離心管
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管
• 即刻置于冰槽里備用或放進(jìn)－70℃冰箱里保存
• （選擇步驟）移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 移取500微升到新的1.5毫升離心管
• 加入預(yù)冷的xx微升去干擾液（Reagent A）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
• 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 放進(jìn)－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用（建議2小時(shí)內(nèi)檢測(cè)）

二、標(biāo)準(zhǔn)樣品配制

• 準(zhǔn)備好5個(gè)1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號(hào)管
• 分別加入xx微升稀釋液（Reagent E）到2至5號(hào)管
• 移取xx微升標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到1號(hào)管
• 小心移取xx微升1號(hào)管的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到2號(hào)管，混勻
• 小心移取xx微升2號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到3號(hào)管，混勻
• 小心移取xx微升3號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到4號(hào)管，混勻
• 將1至5號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見(jiàn)下表

• 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定

• 移取xx微升緩沖液（Reagent B）到新的比色皿
• 加入20微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在37℃溫度下孵育5分鐘
• 加入xx微升底物液（Reagent C）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 室溫下，孵育10分鐘
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟1至10四次
• 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：縱座標(biāo)（Y軸）為吸光讀數(shù)；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)還原型谷胱甘肽濃度（微摩爾/升）

• 樣品測(cè)定

• 移取xx微升緩沖液（Reagent B）到新的比色皿
• 加入20微升上述準(zhǔn)備的待測(cè)樣品 
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在37℃溫度下孵育5分鐘
• 加入xx微升底物液（Reagent C）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 室溫下，孵育10分鐘
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)
• 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)獲得樣品對(duì)應(yīng)還原型谷胱甘肽濃度（微摩爾/升）
• 計(jì)算樣品實(shí)際還原型谷胱甘肽濃度（微摩爾/升）

• 酶標(biāo)儀測(cè)定

• 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測(cè)樣品
• 分別移取xx微升緩沖液（Reagent B）到相應(yīng)孔里
• 分別加入20微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液或待測(cè)樣品 
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 在37℃溫度下孵育5分鐘
• 加入xx微升底物液（Reagent C）
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 室溫下，孵育10分鐘
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)
• 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：縱座標(biāo)（Y軸）為吸光讀數(shù)；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)還原型谷胱甘肽濃度（微摩爾/升）
• 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)獲得樣品對(duì)應(yīng)還原型谷胱甘肽濃度（微摩爾/升）
• 計(jì)算樣品實(shí)際還原型谷胱甘肽濃度（微摩爾/升）

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為50次操作，包括標(biāo)準(zhǔn)樣品
• 操作時(shí)，須戴手套
• 本產(chǎn)品檢測(cè)1至100微摩爾還原型谷胱甘肽
• 如果樣品進(jìn)行了抗干擾液（Reagent A）處理，建議在2小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)；如果需要保存樣品，以后再行檢測(cè)，建議未經(jīng)抗干擾液（Reagent A）處理，直接保存在－70℃冰箱里
• 樣品中避免含有各種還原性化學(xué)物質(zhì)，包括巰基乙醇（2-mercaptoethanol）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol；DTT）、半胱氨酸（cysteine）和N-乙基順丁烯二酰亞胺（N-Ethylmaleimide；NEM）等
• 樣品還原型谷胱甘肽濃度范圍不清楚，建議進(jìn)行系列稀釋樣品2至3次
• 如果用戶(hù)沒(méi)有412nm波長(zhǎng)的濾波器，可以使用405nm波長(zhǎng)替代
• 比色測(cè)定后，比色皿須清洗徹底
• 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高，可以稀釋樣品
• 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)低，可以濃縮樣品或延長(zhǎng)孵育時(shí)間至30或40分鐘
• 本公司提供系列谷胱甘肽分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感