實(shí)驗(yàn)原理

基因定點(diǎn)突變是指通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）等方法改變目的基因的序列，包括堿基的插入、缺失、點(diǎn)突變等�；�因定點(diǎn)突變是基因研究中比較常用的方法，可以短時(shí)間內(nèi)研究目的DNA所表達(dá)的目的蛋白的性狀及表征。

定點(diǎn)突變需要設(shè)計(jì)特定的突變引物。引物長(zhǎng)度一般為25-45 bp，建議選擇30-35bp長(zhǎng)度的引物p。引物至少要11-12個(gè)bp才能與模板搭上，而這種突變PCR要求引物兩邊都能與模板搭上，所以引物的兩邊各設(shè)至少12個(gè)bp。以要突變的位點(diǎn)堿基為中心，加上兩邊11-12 bp的序列。若兩邊引物太短了，很可能會(huì)造成突變實(shí)驗(yàn)失敗。同時(shí)需要設(shè)計(jì)一條反向互補(bǔ)的引物。為保證PCR反應(yīng)正常進(jìn)行，引物設(shè)計(jì)完成后需計(jì)算Tm值，若Tm值不合適，可以適量調(diào)整引物長(zhǎng)度。

實(shí)驗(yàn)材料

PCR引物，質(zhì)�；蛘呋�因組模板，PCR Buffer，PCR用高保真酶，ddH₂O。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1、PCR擴(kuò)增

30 μL PCR（phusion）體系如下：

成分	體積（ul）
水	18.2
Buffer	6
DMSO	0.9
dNTP	0.6
酶	0.3
引物F+R	1.5+1.501
DNA模板

 

2、膠回收

第一輪PCR產(chǎn)物需要進(jìn)行膠回收后再進(jìn)行二輪PCR。

將第一輪PCR得到的條帶進(jìn)行切膠回收后，作為模板進(jìn)行二輪PCR，二輪PCR的引物已第一輪PCR所用的兩端引物。二輪PCR反應(yīng)結(jié)束后需要進(jìn)行純化回收，為下一步的酶切做準(zhǔn)備。

 

3、酶切

通過(guò)酶切回收目的基因片段、載體時(shí)，避開(kāi)基因中的酶切位點(diǎn)，選擇合適限制性內(nèi)切酶。當(dāng)酶切回收目的基因時(shí)要注意目的基因裝在PENTER載體的位置。用限制性內(nèi)切酶處理目的載體時(shí)，要將載體片段的量控制在2μg以內(nèi)，并在酶切反應(yīng)后進(jìn)行去磷酸化處理。

 

30μL酶切體系

成分	體積（ul）
載體DNA	1-2ug
10X Buffer	1
E1	0.8
E2	0.8
水	補(bǔ)足30ul

 

4、連接

根據(jù)片段的大小以及基因的亮度來(lái)調(diào)節(jié)片段連接的比例，一般亞克隆的連接體系如下

成分	體積（ul）
載體DNA	2
目的基因	6
T4連接酶	1
T4 Buffer	1

 

將連接產(chǎn)物放于22℃保持1~2h。

 

5、轉(zhuǎn)化

（1）冰上融化感受態(tài)DH5a,，加1ug/ul的質(zhì)粒1ul于10ul感受態(tài)中，冰上放置30min。

（2）42℃水浴鍋中熱休克90s，迅速轉(zhuǎn)移至冰上2min-5mins。

（3）超凈臺(tái)內(nèi)向各管含質(zhì)粒的感受態(tài)中加入500ul-1ml高壓過(guò)的LB培養(yǎng)基，37℃，低速培養(yǎng)1h。

（4）取100ul轉(zhuǎn)化菌涂板，至菌液快干時(shí)，倒置于37℃恒溫孵箱中培養(yǎng)12-16小時(shí)，次日觀察菌落生長(zhǎng)情況。

6、獲取正確質(zhì)粒

（1）挑取轉(zhuǎn)化子

挑去大腸桿菌轉(zhuǎn)化子至正確的抗性培養(yǎng)基中（KANA、AMP）,并對(duì)HM號(hào)及孔號(hào)做好記錄。

（2）酶切驗(yàn)證

將提取好的質(zhì)粒用合適的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切驗(yàn)證。

10μL酶切驗(yàn)證體系：

成分	體積（ul）
質(zhì)粒DNA	3
10X Buffer	1
E1	0.25
E2	0.25
水	5.5

 

37℃保持30min~1h后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

（3）測(cè)序

將酶切驗(yàn)證正確的樣品送至測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，并做好記錄。

注意事項(xiàng)

1、引物設(shè)計(jì)時(shí)須參照引物設(shè)計(jì)原則，注意引物中的GC含量，引物長(zhǎng)度等，可在引物的兩端選擇G或者C，可以提高引物和模板結(jié)合的概率。

2、PCR過(guò)程中未得到相應(yīng)大小條帶或條帶不單一，應(yīng)適當(dāng)調(diào)整退火溫度，已調(diào)整聚合酶和引物的特異性。

3、使用一輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行第二輪PCR時(shí)，需等量加入作為模板的PCR產(chǎn)物的mol量。

4、某些特殊的限制性酶切酶處理基因時(shí)需要進(jìn)行65℃滅酶處理（如I-CEUI,PI-SCEI），以使內(nèi)切酶變性和DNA分離。

5、連接后轉(zhuǎn)化，注意載體中的抗性基因，可以設(shè)置空白對(duì)照，已轉(zhuǎn)化后得到的單菌落數(shù)量評(píng)估獲取陽(yáng)性克隆的概率。

6、酶切驗(yàn)證后，正確克隆須送測(cè)序驗(yàn)證，使用軟件比對(duì)序列的堿基是否已經(jīng)完成突變。

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