細(xì)胞培養(yǎng)生化分析儀選購(gòu)指南

單抗類藥物的出現(xiàn)為人類一些自身免疫病、癌癥等疑難病的診斷與治療開(kāi)辟了廣闊前景，在為人類健康作出突出貢獻(xiàn)的同時(shí)也為企業(yè)帶來(lái)非常可觀的收入，已成為近年來(lái)銷售額最高的一類生物技術(shù)藥物。雖然哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)要求高、抗體表達(dá)能力低、生產(chǎn)成本高，但具有其它表達(dá)系統(tǒng)無(wú)法取代的優(yōu)勢(shì) ：能夠準(zhǔn)確的完成糖基化、折疊、鏈內(nèi)及鏈間二硫鍵的形成等一系列翻譯后修飾，因此其表達(dá)的抗體在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面更接近天然產(chǎn)物。自 1996 年以來(lái)，F(xiàn)DA批準(zhǔn)的生物技術(shù)產(chǎn)品中，有 2/3 以上是通過(guò)哺乳動(dòng)

物細(xì)胞系統(tǒng)生產(chǎn)的。而中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO）約占哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的90%以上，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（Chinese hamster ovary，CHO）由于具有抗剪切力，易于放大培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)，是目前使用最廣泛的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。目前使用最廣泛的 CHO 表達(dá)系統(tǒng)是二氫葉酸還原酶（DHFR）和谷氨酰胺合成酶（Glutamineynthetase，GS）表達(dá)系統(tǒng)。

近年來(lái)關(guān)于CHO細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的研究越來(lái)越多，在很多情況下生物反應(yīng)器中哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的蛋白質(zhì)類產(chǎn)品的產(chǎn)量都已達(dá)克級(jí)有的甚至可達(dá)10克級(jí)，比80年代中期提高了100多倍，用于治療各種疾病的生物產(chǎn)品的種類也越來(lái)越多，這些成果的取得大都依賴于工程宿主細(xì)胞的改良，培養(yǎng)基的優(yōu)化以及許多其他工藝流程的創(chuàng)新�；�因組的勘探和細(xì)胞工程技術(shù)的普遍應(yīng)用大大方便了科學(xué)家對(duì)宿主細(xì)胞的改造，賦予細(xì)胞生長(zhǎng)和蛋白產(chǎn)品所期望的特點(diǎn)。

 

一、生化分析儀在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用

1. 監(jiān)測(cè)代謝廢物的積累
       目前公認(rèn)，在分批培養(yǎng)和大多數(shù)流加培養(yǎng)中，乳酸、氨以及其它代謝產(chǎn)物隨著時(shí)間的延長(zhǎng)在培養(yǎng)基中積累，這些產(chǎn)物抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)。乳酸一直被認(rèn)為是在生物反應(yīng)器中實(shí)現(xiàn)高密度細(xì)胞濃度的一個(gè)障礙，人們一直在為減少乳酸的產(chǎn)生做了各種不懈的努力�？茖W(xué)家推測(cè)乳酸的積累（即葡萄糖通過(guò)糖酵解生成乳酸，而不是進(jìn)入線粒體完全氧化）一個(gè)原因可能是丙酮酸進(jìn)入線粒體受到了限制，或者TCA循環(huán)和氧化磷酸化發(fā)生了障礙。這一猜測(cè)意味著，如果有足夠的碳流量（主要是丙酮酸）進(jìn)入線粒體產(chǎn)能以及足夠的化學(xué)能流出（ATP）到細(xì)胞質(zhì)中，然后以某種方式通過(guò)負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，葡萄糖的過(guò)度消耗就會(huì)減少，乳酸的產(chǎn)生也隨之降低。一些其他的因素比如高滲透壓以及活性氧的積累都有可能對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)帶來(lái)?yè)p傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞活率以及蛋白產(chǎn)量的降低。乳酸和氨的積累對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的影響比較復(fù)雜，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、蛋白產(chǎn)量以及細(xì)胞代謝的帶來(lái)的變化都有報(bào)道。盡管乳酸和氨可能不是培養(yǎng)基中產(chǎn)生的唯一的抑制物，但是它們的積累確實(shí)影響了細(xì)胞的生長(zhǎng)速度，同時(shí)乳酸和氨也是灌流培養(yǎng)反應(yīng)器中需要去除的主要代謝產(chǎn)物。

    CHO轉(zhuǎn)化細(xì)胞無(wú)論是在氧氣充足還是氧氣缺乏的時(shí)候都傾向通過(guò)糖酵解代謝大量的葡萄糖， 這將導(dǎo)致大量的乳酸的產(chǎn)生，這種現(xiàn)象被稱為Warburg 反應(yīng)。

最近有研究報(bào)道對(duì)細(xì)胞的這種現(xiàn)象做出了解釋，他們認(rèn)為這是細(xì)胞快速的將環(huán)境

中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞生物量的一個(gè)適應(yīng)過(guò)程。然而不同的細(xì)胞所耐受的乳

酸濃度也不一樣， 例如當(dāng)培養(yǎng)基中乳酸濃度高于55mM時(shí)，雜交瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)速率降低50%,當(dāng)乳酸濃度高于60mM時(shí)，CHO細(xì)胞的生長(zhǎng)速率降低25%。

1. 確定流加工藝關(guān)鍵控制點(diǎn)

目前上市的重組抗體中絕大多數(shù)是采用流加（Fed batch）培養(yǎng)工藝生產(chǎn)，這主要由于與之配套的生物反應(yīng)器（攪拌罐、氣升罐等）制造成熟，可線形放大（最大至20,000L），操作簡(jiǎn)單等原因。但是，流加培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗、代謝廢物積累，以及產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定等問(wèn)題。因此需要對(duì)流加過(guò)程進(jìn)行監(jiān)控以減少代謝副產(chǎn)物的積累， 使細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間得以延長(zhǎng)，細(xì)胞密度以及蛋白類藥物的產(chǎn)量也都能得到增加。

而流加培養(yǎng)中減少代謝物的主要途徑就是通過(guò)控制補(bǔ)料方式減少可利用的葡萄糖以及谷氨酰胺使葡萄糖的濃度維持在較低的水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)外部的葡萄糖和氨基酸濃度控制在較低水平時(shí)，細(xì)胞代謝傾向于向更有效的途徑轉(zhuǎn)變，過(guò)度代謝的流量和代謝物的排泄將大大減弱， 表現(xiàn)為培養(yǎng)基中乳酸的生成大大減少， 細(xì)胞代謝從一個(gè)高產(chǎn)乳酸的狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榈彤a(chǎn)乳酸的狀態(tài)。

1. 優(yōu)化培養(yǎng)基配方

動(dòng)物細(xì)胞的體外培養(yǎng)，涉及生物反應(yīng)器的物理參數(shù)（溫度、pH、DO、DCO2等）、培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分（葡萄糖、谷氨酰胺、氨基酸、維生素等）的消耗，以及自身代謝產(chǎn)物（乳酸、氨、重組蛋白等）的積累與生理生化參數(shù)（細(xì)胞密度、活性，能荷等）的變化。作為重組抗體生產(chǎn)的“細(xì)胞工廠”，上述過(guò)程參數(shù)的改變會(huì)直接影響生產(chǎn)細(xì)胞系的活性與重組抗體的收率。比如：當(dāng)乳酸（58 mM）、滲透壓（382 mOsm/kg）、氨（5.1 mM）參數(shù)超過(guò)其相應(yīng)的閾值，細(xì)胞活性和抗體產(chǎn)量均會(huì)明顯下降[6]。目前，業(yè)內(nèi)已經(jīng)對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程參數(shù)進(jìn)行了深入的研究，在動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)中下述參數(shù)的控制也已成定式（見(jiàn)下表）。

 

	參數(shù)	控制（或測(cè)定）范圍	檢測(cè)手段	控制策略
營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)	葡萄糖	0~10g/L	生化分析儀、酶試劑盒	葡萄糖限制性流加
	谷氨酰胺	0~10mM		谷氨酰胺限制性流加
	氨基酸	0~10mM	HPLC	流加濃縮培養(yǎng)基
	核苷酸	0~10mM	HPLC
代謝產(chǎn)物	乳酸	0~50mM	生化分析儀、 酶試劑盒	使用半乳糖替代葡萄糖
	氨	1~10mM		使用丙酮酸、谷氨酸替代谷氨酰胺

流加培養(yǎng)工藝的優(yōu)化主要集中在基礎(chǔ)培養(yǎng)基、流加培養(yǎng)基以及流加策略上，其優(yōu)化的原則是根據(jù)細(xì)胞的代謝特點(diǎn)設(shè)計(jì)補(bǔ)料培養(yǎng)基，用于補(bǔ)充易耗成分，降低副產(chǎn)物積累。

• 生化分析儀選購(gòu)原則

1.生化分析儀的分類

生化分析儀又常被稱為生化儀，是采用光電比色原理來(lái)測(cè)量體液中某種特定化學(xué)成分的儀器。由于其測(cè)量速度快、準(zhǔn)確性高、消耗試劑量小，現(xiàn)已在各級(jí)醫(yī)院、防疫站、計(jì)劃生育服務(wù)站得到廣泛使用。配合使用可大大提高常規(guī)生化檢驗(yàn)的效率及收益。

  常見(jiàn)的生化分析儀基于兩種基本原理：第一是酶比色法也就是傳統(tǒng)意義上的生化分析儀，第二是類是隨著生物科技的發(fā)展酶分子改造技術(shù)、酶的固定化技術(shù)的發(fā)展酶電極法生化分析儀應(yīng)用而生，主要應(yīng)用于戰(zhàn)地醫(yī)療、ICU等對(duì)檢測(cè)速度、檢測(cè)環(huán)境又特殊要求的場(chǎng)合。

1.1光學(xué)比色生化分析儀發(fā)展歷程

第一代：分光光度計(jì)

第二代：半自動(dòng)生化分析儀：半自動(dòng)生化分析儀指在分析過(guò)程中的部分操作（如加樣、保溫、吸入比色、結(jié)果記錄等某一步驟）需手工完成，而另一部分操作則可由儀器自動(dòng)完成。

第三代：全自動(dòng)生化分析儀：1957年誕生于美國(guó)，全自動(dòng)生化分析儀，從加樣至出結(jié)果的全過(guò)程完全由儀器自動(dòng)完成。操作者只需把樣品放在分析儀的特定位置上，選用程序開(kāi)動(dòng)儀器即可等取檢驗(yàn)報(bào)告。按照儀器結(jié)構(gòu)原理可分為 ：連續(xù)流動(dòng)式（管道式）、分立式、離心式和干片式四類。

1.1.2光學(xué)比色生化分析儀檢測(cè)過(guò)程

（1）檢測(cè)原理（針對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)項(xiàng)目）：底物經(jīng)過(guò)一系類的酶的作用生成過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫與4-氨基安替比林反應(yīng)生成紅色醌類物質(zhì)在540nm處有吸收峰。

（2）檢測(cè)過(guò)程：加樣——加試劑——混合——保溫反應(yīng)——檢測(cè)——輸出結(jié)果。

 

1. 酶電極法生化分析儀

2.1 檢測(cè)原理：底物經(jīng)過(guò)一系類的酶的作用生成過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫在電極表面形成電勢(shì)差，電勢(shì)差的大小與過(guò)氧化氫的濃度成正比。

2.1 檢測(cè)過(guò)程：定標(biāo)——進(jìn)樣——酶膜表面反應(yīng)——檢測(cè)——輸出結(jié)果

3.生化分析儀檢測(cè)速度

由生化分析儀的誕生背景、檢測(cè)原理、檢測(cè)過(guò)程可知，兩種方法的生化分析儀在檢測(cè)同一個(gè)樣本，同一個(gè)項(xiàng)目時(shí)間上有很大差異。

	西爾曼科技M900生化分析儀	羅氏cedex bio	Nova bioprofile 400	YSI 2950D	備注
檢測(cè)原理	酶膜電極法	酶-光學(xué)比色法	酶膜電極法	酶膜電極法
單項(xiàng)目檢測(cè)時(shí)間（以葡萄糖為例）	45秒	5-10分鐘	45秒	45秒
儀器準(zhǔn)備時(shí)間（開(kāi)機(jī)自檢、清洗、試劑準(zhǔn)備、定標(biāo)等）	5分鐘	15-20分鐘	5分鐘	5分鐘	正常時(shí)間，項(xiàng)目多，定標(biāo)通不過(guò)，有可能準(zhǔn)備時(shí)間超過(guò)30分鐘

1. 單個(gè)樣本檢測(cè)成本

生化分析儀目前的主流應(yīng)用在醫(yī)療領(lǐng)域，大型醫(yī)療機(jī)構(gòu)每天有上千個(gè)樣本進(jìn)行檢測(cè)，因此生化分析儀的試劑包正常情況下也是500T起，并且每個(gè)公司的生化分析儀都會(huì)有自己特殊條碼系統(tǒng)，耗材之間不能通用，由于條碼系統(tǒng)的存在，耗材很容易實(shí)現(xiàn)壽命控制（試劑包從掃碼之日開(kāi)始計(jì)時(shí)，一定時(shí)間之后試劑包自動(dòng)失效，要求客戶重新更換試劑包，否則儀器無(wú)法檢測(cè)），臨床生化分析儀的盈利模式主要依靠耗材，所以常規(guī)醫(yī)療用生化分析儀不適合細(xì)胞培養(yǎng)行業(yè)。

	西爾曼科技M900生化分析儀	羅氏cedex bio	Nova bioprofile 400	YSI 2950D	備注
檢測(cè)原理	酶膜電極法	酶-光學(xué)比色法	酶膜電極法	酶膜電極法
穩(wěn)定性	cv＜2%	cv＜5%	cv＜2.5%	cv＜2%	穩(wěn)定性
準(zhǔn)確性	＜2%	＜2%	＜2%	＜2%	準(zhǔn)確性
單項(xiàng)目檢測(cè)成本（谷氨酰胺為例）	0.5元	10元左右	10元左右	10元左右	按每天50次檢測(cè)量，試劑盒開(kāi)包后有保質(zhì)期，檢測(cè)樣本越少，單次檢測(cè)成本越高

 

1. 日常維護(hù)成本

目前無(wú)論是細(xì)胞行業(yè)還是臨床，生化分析儀即使不用也要進(jìn)行日常維護(hù)，所以作為工業(yè)客戶，本著為公司經(jīng)濟(jì)效益著想，首先要考慮的就是儀器的日常維護(hù)的耗材成本、人力資源成本和時(shí)間成本。

	西爾曼科技M900生化分析儀	羅氏cedex bio	Nova bioprofile 400	YSI 2950D	備注
生化分析儀光源（燈泡）	——	6000	——	——	按照1000h壽命計(jì)算，每天開(kāi)機(jī)10個(gè)小時(shí)
濾光片	——	4000	——	——	8組濾光片，平均每年更換2片
生化模塊清洗緩沖液	500	2000	15000	5000	按照一年計(jì)算
離子模塊清洗液	5000	24000	24000	24000	按照上機(jī)壽命30天
氣體模塊清洗液	——		50000	——	按照上機(jī)壽命30天
一年維護(hù)成本	5500	36000	89000	29000
耗材貨期	一周內(nèi)	2個(gè)月	2個(gè)月	2個(gè)月

三、總結(jié)

生物類似藥因結(jié)構(gòu)極為復(fù)雜，研發(fā)壁壘大大高于化學(xué)仿制藥，存在研發(fā)周期長(zhǎng)、資金投入大、技術(shù)要求高的特點(diǎn)。從行業(yè)普遍規(guī)律來(lái)看，單抗生物類似藥的研發(fā)大約需要約 5-10 年的時(shí)間，研發(fā)費(fèi)用約 2-3 億美元。但對(duì)比生物創(chuàng)新藥，不僅研發(fā)和審批難度大大降低，還可以享受創(chuàng)新藥培育好的市場(chǎng)，對(duì)于制藥企業(yè)來(lái)說(shuō)，特別是資金和原創(chuàng)能力不足的企業(yè)，研發(fā)生物類似藥可保證以相對(duì)較低的投入獲取相對(duì)高的收益。隨著布局生物類似物研發(fā)的企業(yè)逐步增多、融資渠道日益多元，必將會(huì)有越來(lái)越多的制藥企業(yè)押寶生物類似、蛋白類藥物。

3月20日，在十三屆全國(guó)人大一次會(huì)議閉幕后，國(guó)務(wù)院總理李克強(qiáng)在答記者問(wèn)時(shí)表示，我們要較大幅度地降低進(jìn)口稅率，對(duì)抗癌藥品力爭(zhēng)降到零稅率。這對(duì)長(zhǎng)期依附于進(jìn)口的蛋白類制藥企業(yè)是個(gè)巨大的挑戰(zhàn)，進(jìn)口藥品勢(shì)必大幅降價(jià)。因此降低企業(yè)日常運(yùn)營(yíng)成本、掌握細(xì)胞培養(yǎng)核心技術(shù)、提高細(xì)胞表達(dá)水平是取得最終成功的必由之路！西爾曼科技愿為您的細(xì)胞培養(yǎng)優(yōu)化過(guò)程提供專業(yè)、可靠的解決方案。