1 透射光成像

采用高內(nèi)涵進(jìn)行 3D 細(xì)胞球的透射光成像是一種常用手段。通過透射光的成像，可以從整體上觀察細(xì)胞球的形態(tài)和大小，可以方便地進(jìn)行細(xì)胞凋亡、生長(zhǎng)抑制等方法的檢測(cè)。借助高內(nèi)涵的圖像分析功能，能夠非常簡(jiǎn)便地實(shí)現(xiàn)細(xì)胞球的識(shí)別、細(xì)胞球大小的測(cè)定以及細(xì)胞球細(xì)胞數(shù)量的評(píng)判。

2 熒光成像

2.1 寬場(chǎng)熒光成像技術(shù)

利用寬場(chǎng)熒光成像技術(shù)，能夠利用各種熒光試劑盒，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞球內(nèi)細(xì)胞凋亡的準(zhǔn)確測(cè)量和評(píng)判，并能夠通過抗體標(biāo)記技術(shù)準(zhǔn)確測(cè)量細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。對(duì)于寬場(chǎng)熒光成像，由于焦平面圖像受到非焦平面的熒光干擾，通常無法獲得準(zhǔn)確的細(xì)胞數(shù)量 ( 僅能通過熒光陽性的面積大小進(jìn)行近似計(jì)算 )。另外對(duì)于不同 Z 層面的細(xì)胞也缺乏分辨能力，造成結(jié)果有時(shí)有較大偏差。

可同時(shí)將寬場(chǎng)熒光成像技術(shù)和透射光成像技術(shù)結(jié)合，從而同時(shí)實(shí)現(xiàn)以上的功能。

2.2 共聚焦成像技術(shù)

采用具有共聚焦功能的高內(nèi)涵系統(tǒng)，不但能夠獲得更清晰的細(xì)胞球圖像，同時(shí)還能夠獲得細(xì)胞球內(nèi)部的圖像。通過共聚焦成像，能夠獲得細(xì)胞球內(nèi)任意層面的圖像，可獲得非常準(zhǔn)確的細(xì)胞定量信息，包括細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞凋亡、蛋白表達(dá)、蛋白分布等，而不像寬場(chǎng)熒光成像和透射光成像，僅能獲得細(xì)胞球整體信息。

3 3D 細(xì)胞球的分析技術(shù)

3.1 3D 細(xì)胞球分析的目的和意義

3D 細(xì)胞球技術(shù)是一種用于生物學(xué)研究、藥物篩選和藥物評(píng)價(jià)的非常有潛力的技術(shù)。由于其能夠通量化和規(guī)�；�，除了新的相關(guān)技術(shù)用于腫瘤治療研究外，大部分用于藥物的篩選和評(píng)價(jià)。而對(duì)于藥物的篩選和評(píng)價(jià)，通過量化不同干預(yù) / 藥物下的細(xì)胞球的變化 ( 形態(tài)學(xué)和功能 ) 都對(duì)于藥物研究有著重要意義，高準(zhǔn)確度、無偏移地對(duì)細(xì)胞球和細(xì)胞球內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行定量就變得非常重要，這不但會(huì)影響藥物篩選的結(jié)果，對(duì)于區(qū)分不同 Hit 的藥效或作用，尤其是腫瘤個(gè)性化治療效果的體外準(zhǔn)確評(píng)判，具有非常關(guān)鍵的作用。

3.2 2D 分析方法

3.2.1. 2D 分析方法的實(shí)現(xiàn)

細(xì)胞球作為一個(gè)三維結(jié)構(gòu)，可通過其二維投影或二維結(jié)果來間接反映三維結(jié)構(gòu)的特性。對(duì)于寬場(chǎng)熒光成像和明場(chǎng)成像，由于其 Z 軸分辨能力較弱，通常難以直接進(jìn)行三維重構(gòu)和分析，而主要進(jìn)行二維方法進(jìn)行分析。當(dāng)然，目前有多種 3D 反卷積算法，如AutoQuant、Huygens 等提供的 3D 反卷積盲算法能夠大大提高寬場(chǎng)熒光的 Z 軸分辨率，其結(jié)果可以以三維的方法進(jìn)行分析，參考后文。

要獲得二維投影圖像，需要對(duì)細(xì)胞球進(jìn)行 Z 序列成像后，來獲得二維的最終投影圖像。

如上圖，先對(duì)細(xì)胞球的各個(gè)層面位置進(jìn)行 Z 序列成像后，對(duì)獲得的Z序列圖像進(jìn)行景深擴(kuò)展或 Best Focus 處理后，能夠得到3D 細(xì)胞球的高質(zhì)量 2D 投影圖像。其中 Z 序列圖像通常不采用最大投影 (Maximal Projection) 的方法，因?yàn)樵摲椒〞?huì)造成背景信號(hào)的累積，降低最終 2D 投影圖像的信噪比，并最終影響到分析結(jié)果。獲得的 2D 投影圖像，采用常規(guī)的 2D 分析方法，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)于 3D 細(xì)胞球的定量分析。

對(duì)于共聚焦成像系統(tǒng)，由于系統(tǒng)本身就提供很高的 Z 軸分辨率，可通過對(duì) Z 序列圖像的每一層圖像進(jìn)行 2D 分析，對(duì)獲得的每一個(gè) 2D 結(jié)果平均化 / 或求和后，來反映 3D 結(jié)構(gòu)的信息。

3.2.2. 2D 分析方法的缺陷

2D 是 3D 的投影或者子集。因此當(dāng)通過共聚焦或 3D 反卷積獲得了 3D 細(xì)胞的 Z 序列圖像，獲得了細(xì)胞球的 3D 內(nèi)部信息后，通過 2D 的方法進(jìn)行分析獲得的結(jié)果只能從一個(gè)角度了解一個(gè) 3D 結(jié)構(gòu)的信息，而無法獲得全貌。因?yàn)?2D 只是 3D 的一個(gè)子集，所以 2D 的結(jié)果會(huì)由于方法的不同，會(huì)產(chǎn)生較大偏差 ( 如下圖 )：

(1) 采用 2D 投影法會(huì)造成結(jié)果明顯偏低

右側(cè)為 3D 細(xì)胞球 Z 軸掃描其中的兩個(gè)層面。其中層面 3 和層面 5 在圖像相同的位置上 ( 紅圈 ) 均有細(xì)胞，即在同一個(gè)位置上的上面和下面均有細(xì)胞，這些細(xì)胞在獲得景深擴(kuò)展圖像中就類似于同一個(gè)細(xì)胞，造成 2D 投影法分析獲得的細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果明顯偏低。

(2) 采用分層求和法會(huì)造成結(jié)果明顯偏高

右側(cè)為 3D 細(xì)胞球 Z 軸掃描其中的兩個(gè)層面。其中層面 8 和層面 9 均拍攝到了同一個(gè)的不同層面，造成分層求和法分析獲得的細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果明顯偏高。

(3) 當(dāng)需要檢測(cè)不同細(xì)胞的距離和位置等空間信息時(shí)，兩種方法也會(huì)造成明顯的問題，如分層求和法無法進(jìn)行位置和距離信息的測(cè)定； 2D 投影法由于獲得的只是一個(gè)平面的投影，其結(jié)果會(huì)明顯偏低或錯(cuò)誤 ( 如細(xì)胞上下層疊時(shí) )

3.3 3D 分析方法

當(dāng)然，要想全面準(zhǔn)確地獲得 3D 細(xì)胞球的信息只能通過 3D 分析方法。3D 分析方法能夠自動(dòng)對(duì) 3D 細(xì)胞球進(jìn)行三維空間重構(gòu)，并在重構(gòu)的三維空間進(jìn)行細(xì)胞的定量測(cè)量 ( 細(xì)胞數(shù)量，大小，體積，表面積等 ) 和位置信息測(cè)量 ( 空間距離、位置等 )。

目前有一門新興的細(xì)胞應(yīng)力學(xué)，通過對(duì)三維腫瘤細(xì)胞球、腫瘤組織中細(xì)胞的“擁堵特征”和“相變”( 通過三維結(jié)構(gòu)內(nèi)細(xì)胞之間接觸面積和空間細(xì)胞形態(tài) ) 對(duì)腫瘤進(jìn)行研究，并對(duì)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移基質(zhì)研究取得相當(dāng)進(jìn)展。

四、ImageXpress Micro 家族產(chǎn)品進(jìn)行 3D 細(xì)胞球培養(yǎng)和檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)

1 可用于所有 3D 細(xì)胞球方法

ImageXpress Micro 家族高內(nèi)涵產(chǎn)品具有極強(qiáng)的兼容性和擴(kuò)展性，能夠用于目前所有的 3D 細(xì)胞球的成像，并且同時(shí)支持新近出現(xiàn)的 3D 成像新方法，如 3D 細(xì)胞微流控、3D 微器官等實(shí)驗(yàn)的快速成像和分析。優(yōu)化完善超過 15 年的激光自動(dòng)聚焦系統(tǒng)能夠快速找到 3D 細(xì)胞球的焦平面位置進(jìn)行清晰成像。激光自動(dòng)聚焦同時(shí)結(jié)合圖像自動(dòng)聚焦技術(shù)，可以在不同孔內(nèi) 3D 細(xì)胞球大小不同和懸浮高度不同的情況下也能準(zhǔn)確快速找到 3D 細(xì)胞球的精確焦平面位置，實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確的細(xì)胞球成像。

2 完善的激光自動(dòng)聚焦 + 圖像自動(dòng)聚焦，支持各種 3D 細(xì)胞球制作方法和未來新耗材的升級(jí)空間

IXM 系列高內(nèi)涵系統(tǒng)完善且獨(dú)特的激光自動(dòng)聚焦系統(tǒng)，能夠跟蹤樣品內(nèi)的任意平面，達(dá)到快速精確的聚焦目的，能夠在 0.3 s內(nèi)快速根據(jù) 3D 細(xì)胞球板材的設(shè)定準(zhǔn)確定位細(xì)胞球。

以上為 Hanging drop plate 獲得的 3D 細(xì)胞球進(jìn)行快速激光自動(dòng)聚焦的示意，IXM 能夠自動(dòng)獲得多個(gè)界面的反射光，并確定細(xì)胞球的位置。因?yàn)榧?xì)胞球穩(wěn)定懸浮于液面上面 ( 表面張力作用 )，通過確認(rèn)細(xì)胞球的大概直徑，系統(tǒng)可通過細(xì)胞球液面界面為基準(zhǔn)，快速準(zhǔn)確地獲得細(xì)胞球 Z 軸精確位置。若通過圖像自動(dòng)聚焦進(jìn)行設(shè)定，系統(tǒng)找到細(xì)胞球 Z 軸精確位置后，能夠精確定位細(xì)胞球的任意層面。

3 高效靈活的 Z 序列采集，節(jié)省時(shí)間和空間

ImageXpress Micro 家族產(chǎn)品整合有高效方便的 3D 成像功能，能夠非常方便地進(jìn)行細(xì)胞球的 3D 成像和 2D 成像。系統(tǒng)提供了自動(dòng)化的 Best Focus 景深擴(kuò)展功能，一次設(shè)置即可獲得，無需后續(xù)操作。靈活的功能允許單獨(dú)采集 3D Stack 圖像或 2D 景深擴(kuò)展圖像，或者同時(shí)采集，方便客戶平衡 3D 的準(zhǔn)確成像和 2D 景深擴(kuò)展的需求。

4 轉(zhuǎn)盤共聚焦 + 3D 反卷積

ImageXpress Micro Confocal (IXM-C) 是一款高度靈活且具有高成像質(zhì)量的共聚焦高內(nèi)涵系統(tǒng)。其具有的多種共聚焦轉(zhuǎn)盤能夠?qū)崿F(xiàn)高通量和高分辨率的成像。寬場(chǎng)或共聚焦成像的基礎(chǔ)上進(jìn)行反卷積處理獲得更高分辨率和信噪比的圖像是生物學(xué)成像的常用方法。IXM-C 在轉(zhuǎn)盤共聚焦的基礎(chǔ)上同時(shí)具有 3D 反卷積功能，其獲得的轉(zhuǎn)盤共聚焦圖像本身具有極好的 Z 軸分辨率。通過結(jié)合 3D 反卷積功能，能夠進(jìn)一步提高 XYZ 方向上的分辨率，能夠獲得更加清晰的圖像細(xì)節(jié) ( 如上圖 )。

5 強(qiáng)大的 3D 分析功能

如前所述，3D 細(xì)胞球的圖像通過不同的 2D 識(shí)別分析可獲得一定的數(shù)據(jù)，但采用 2D 分析方法的缺陷十分明顯 ( 見前文 )。3D細(xì)胞球?qū)嶒?yàn)準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)結(jié)果依賴于 3D 分析工具來實(shí)現(xiàn)。ImageXpress Micro 高內(nèi)涵系統(tǒng)具有高性能的 3D 分析工具�？梢詫�(shí)現(xiàn)軟件自動(dòng)在三維層面識(shí)別細(xì)胞，并自動(dòng)進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)重構(gòu)，并在重構(gòu)的三維結(jié)構(gòu)中進(jìn)行細(xì)胞的識(shí)別和分析。

6 并行分析計(jì)算

ImageXpress PowerCore 是用于 MD 高內(nèi)涵系統(tǒng)的并行分析計(jì)算功能，能夠?qū)崿F(xiàn)以下有用功能：

A：圖像采集過程中同步進(jìn)行圖像分析 ( 不會(huì)影響圖像采集速度 )。

B：大大加速圖像分析所用時(shí)間。

當(dāng)進(jìn)行 3D 成像和分析時(shí)，由于需要進(jìn)行不同層面的多個(gè) Z 軸圖像來進(jìn)行 3D 信息的準(zhǔn)確獲取，獲得的圖像數(shù)量和分析負(fù)荷會(huì)明顯增大。采用 ImageXpress PowerCore 能夠明顯提升圖像分析的速度，大幅度提升通量，并能夠提供比圖像采集速度更快的分析速度。以下例子能夠直觀地反映出 ImageXpress PowerCore 的強(qiáng)大功能。

7 3D 細(xì)胞球 + 細(xì)胞功能檢測(cè)

常規(guī)體細(xì)胞的細(xì)胞系或者腫瘤細(xì)胞系是做 3D 細(xì)胞球?qū)嶒?yàn)的常規(guī)對(duì)象細(xì)胞。對(duì)于某些特殊細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞，其正常生理特性依賴于其特定的細(xì)胞特性，如動(dòng)作電位、局部電位變化、離子釋放等。MD 高內(nèi)涵系統(tǒng)不但能夠進(jìn)行 3D 等復(fù)雜實(shí)驗(yàn)的成像分析，包括以上特殊細(xì)胞類型的諸如動(dòng)作電位變化頻率、速度等能夠進(jìn)行快速成像和特性分析。

iCell 分化獲得的神經(jīng)細(xì)胞，在小型凝膠培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)成為神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。通過鈣離子試劑的標(biāo)記，可以看到神經(jīng)細(xì)胞上由于動(dòng)作電位引起的鈣離子釋放，說明神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)功能良好。軟件系統(tǒng)能夠自動(dòng)識(shí)別熒光標(biāo)記的細(xì)胞，并自動(dòng)分析電信號(hào) ( 鈣離子釋放 ) 的變化頻率和幅度。

五、總結(jié)

3D 細(xì)胞球檢測(cè)技術(shù)會(huì)帶來較傳統(tǒng) 2D 細(xì)胞檢測(cè)方法更加準(zhǔn)確可靠，且更加接近于臨床實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。準(zhǔn)確的結(jié)果在藥物篩選上能夠大大降低藥物篩選的成本和時(shí)間，而在科研上，由于其先天的優(yōu)勢(shì)，能夠更加真實(shí)地反映出細(xì)胞的生物學(xué)表現(xiàn)和反應(yīng)。3D 細(xì)胞球技術(shù)是一種基礎(chǔ)方法，隨著技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了更多特異化的方法，如類器官，微組織等方法，為生物學(xué)研究和藥物篩選提供了更加有力的武器。

3D 細(xì)胞球技術(shù)，由于其本質(zhì)為三維結(jié)構(gòu)，因此，只有通過三維成像和分析技術(shù)才能獲得準(zhǔn)確可靠的結(jié)果。Molecular Devices 公司的 ImageXpress Micro 系列高內(nèi)涵系統(tǒng)，不但提供了 3D 細(xì)胞球技術(shù)實(shí)現(xiàn)的所有細(xì)節(jié)和功能，包括3D 成像及 3D 分析，其對(duì)于目前市場(chǎng)上 3D 細(xì)胞球技術(shù)的耗材實(shí)現(xiàn)了全兼容。其完善的激光自動(dòng)聚焦+圖像自動(dòng)聚焦技術(shù)有極大的容忍性和開放性，能夠?qū)崿F(xiàn)未來新型耗材和方法的檢測(cè)和分析。MetaXpress PowerCore 高內(nèi)涵并行加速軟件系統(tǒng)能夠大大提高系統(tǒng)分析通量，加速藥物檢測(cè)和時(shí)間和人力成本。