致病微生物系列

致瀉大腸埃希氏菌鑒定劑盒（PCR法）

• 產(chǎn)品說(shuō)明

致瀉大腸埃希氏菌鑒定劑盒參照《GB4789.6—2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)》進(jìn)行設(shè)計(jì)，可針對(duì)食品樣品中的致瀉大腸埃希氏菌特異核酸片段進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)電泳判斷樣品的鑒定結(jié)果。該產(chǎn)品檢出限為10^3 cfu/ml（使用旋達(dá)071021M細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取1 ml 10^3cfu/ml增菌液的細(xì)菌基因組DNA作為模板）。

一管式檢測(cè)試劑為本公司研發(fā)的產(chǎn)品，與傳統(tǒng)PCR法檢測(cè)試劑具有等效的檢測(cè)性能，其中的固封液不影響檢測(cè)反應(yīng)與熒光檢測(cè)性能，并且對(duì)試劑蒸發(fā)與氣溶膠污染起到一定的防范作用。該產(chǎn)品無(wú)需分裝試劑，有效減少反復(fù)凍融及分裝過(guò)程中造成的試劑活性下降及試劑污染，無(wú)需增設(shè)試劑配置區(qū)，省時(shí)省力省空間。（該產(chǎn)品反應(yīng)液中已含熒光染料，可直接使用熒光定量PCR儀進(jìn)行定性檢測(cè)）

◆ 產(chǎn)品組成（96測(cè)試）

◆ 所需儀器

ABI ，BioRad，TaKaRa等PCR擴(kuò)增儀，電泳儀，凝膠成像儀等電泳配套設(shè)備。（使用熒光定量PCR儀進(jìn)行定性判讀時(shí)則無(wú)需電泳設(shè)備）

◆ 自備耗材和儀器

①滅菌1.5mL或2.0mL離心管；②冰盒；③移液器（1-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套滅菌吸頭；④離心機(jī)；⑤渦旋混勻器；⑥金屬浴。

◆ 樣品處理

參照《GB4789.6—2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)》中的操作步驟進(jìn)行前增菌。建議使用試劑配套細(xì)菌基因組DNA提取系列產(chǎn)品。

◆ 實(shí)驗(yàn)操作

1．添加模板（樣本制備區(qū)，放置于冰盒中進(jìn)行）

取所待檢樣品數(shù)+3的12聯(lián)反應(yīng)管，將試劑完全解凍，分離心30s。離心后揭開(kāi)封口膜，使用穿刺加樣法穿過(guò)固封層向每管反應(yīng)液中分別加入2μL模板（或直接使用無(wú)菌吸頭挑取少許待檢菌落至反應(yīng)管中）。

加樣示例：（有2個(gè)待測(cè)樣品）

取5排12聯(lián)反應(yīng)管，按順序第一排全部加NG-DW，第二排全部加NG-Ecoli，第三排全部加樣品1，第四排全部加樣品2，第五排全部加PG-Ecoli。

蓋好配套的PCR管蓋后，渦旋混勻30s，離心1min，立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

2. 擴(kuò)增反應(yīng)（擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)）

   按下列條件設(shè)置擴(kuò)增反應(yīng)：（如需使用熒光法進(jìn)行檢測(cè)請(qǐng)選擇FAM通道）

3. 產(chǎn)物電泳（擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)）

稱(chēng)量4. 0g瓊脂糖粉，加入至200 mL的1×TAE電泳緩沖液中，充分混勻。使用微波爐反復(fù)加熱至沸騰，直到瓊脂糖粉完全融化形成清亮透明的溶液。待瓊脂糖溶液冷卻至60℃左右時(shí)，加入溴化乙錠( EB )至終濃度為0.5μg/mL，充分混勻后，輕輕倒入已放置好梳子的模具中，凝膠長(zhǎng)度要大于10cm，厚度宜為3mm~5mm。檢查梳齒下或梳齒間有無(wú)氣泡，用一次性吸頭小心排掉瓊脂糖凝膠中的氣泡。當(dāng)瓊脂糖凝膠完全凝結(jié)硬化后,輕輕拔出梳子，小心將膠塊和膠床放入電泳槽中，樣品孔放置在陰極端。向電泳槽中加入1×TAE電泳緩沖液，液面高于膠面1mm~2mm。將 5μL PCR產(chǎn)物與1μL 6×上樣緩沖液混勻后，用微量移液器吸取混合液垂直伸入液面下膠孔，小心上樣于孔中；陽(yáng)性對(duì)照的 PCR 反應(yīng)產(chǎn)物加入到最后一個(gè)泳道;第一個(gè)泳道中加入 2 μ L 分子量 Marker 。接通電泳儀電源，根據(jù)公式：電壓=電泳槽正負(fù)極間的距離（cm）×5V/cm計(jì)算并設(shè)定電泳儀電壓數(shù)值；啟動(dòng)電壓開(kāi)關(guān)，電泳開(kāi)始以正負(fù)極鉑金絲出現(xiàn)氣泡為準(zhǔn)。電泳30min~45min后，切斷電源。取出凝膠放入凝膠成像儀中觀察結(jié)果，拍照并記錄數(shù)據(jù)。

• 可使用Gold view、Gal-Rad等等效的核酸熒光染料替代EB。
• 推薦使用DNA Marker：DL2000或100bp ladder，等可指示100bp~1500bp條帶的Marker。

• 結(jié)果分析

• 陰陽(yáng)性判讀：

進(jìn)行電泳檢測(cè)時(shí)，需對(duì)比Marker進(jìn)行判斷，當(dāng)目的靶標(biāo)對(duì)應(yīng)位置出現(xiàn)單一顯著條帶時(shí)可判斷該靶標(biāo)為陽(yáng)性；否則為該靶標(biāo)檢測(cè)為陰性。（使用熒光定量PCR儀檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)孔Ct≤30時(shí)判斷該孔為陽(yáng)性；當(dāng)檢測(cè)孔Ct＞30時(shí)，該檢測(cè)孔為陰性）

示例電泳圖

• 有效性判讀：

需同時(shí)滿(mǎn)足：1.空白對(duì)照中所有泳道均為陰性；2.陰性對(duì)照中uidA泳道陽(yáng)性，其余泳道陰性；2.陽(yáng)性對(duì)照中所有泳道陽(yáng)性，此時(shí)可判斷實(shí)驗(yàn)有效。如無(wú)法滿(mǎn)足上述條件，則實(shí)驗(yàn)無(wú)效，需重復(fù)實(shí)驗(yàn)；如重復(fù)后結(jié)果仍為無(wú)效，請(qǐng)于本公司技術(shù)支持聯(lián)系。

• 結(jié)果判讀：

在實(shí)驗(yàn)有效的情況下，可根據(jù)下表進(jìn)行判讀：

• 97%以上大腸埃希氏菌為uidA陽(yáng)性，可參考陰性對(duì)照中該基因檢測(cè)結(jié)果判斷擴(kuò)增效果；
• 當(dāng)結(jié)果判定為EPEC陽(yáng)性時(shí)，若bfpB靶標(biāo)為陽(yáng)性則說(shuō)明樣品含有典型EPEC；若bfpB靶標(biāo)為陰性則說(shuō)明樣品為非典型EPEC；
• 當(dāng)結(jié)果判定為STEC/EHEC陽(yáng)性時(shí)，若eae靶標(biāo)為陽(yáng)性則說(shuō)明樣品含有典型EHEC；若eae靶標(biāo)為陰性則說(shuō)明樣品為非典型EHEC。

◆ 注意事項(xiàng)

1．本試劑檢測(cè)靈敏度高。為了防止污染，實(shí)驗(yàn)要分區(qū)操作。

   1）第一區(qū)：樣本制備區(qū)。

   2）第二區(qū)：擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)。

   ★ 分區(qū)之間最好進(jìn)行物理性隔離，避免人為因素造成的污染。

2. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中穿戴工作服和乳膠手套，使用移液器，試驗(yàn)產(chǎn)生的所有廢棄物及時(shí)處理。

3．嚴(yán)格按照操作步驟操作，試劑配制和加樣等步驟請(qǐng)嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)要求在冰上操作。

4．反應(yīng)液中的成分對(duì)光敏感，應(yīng)避光保存。試劑使用前要完全解凍，但應(yīng)避免反復(fù)凍融，推薦使用前離心30秒。

5．不同批號(hào)試劑請(qǐng)勿混合使用，在有效期內(nèi)使用。