在微流控平臺下高通量研究3D神經網絡的形態(tài)特征
介紹：
建立生理學上模擬體內環(huán)境的體外模型對了解神經系統(tǒng)疾病機制和藥物研發(fā)具有至關重要的作用。干細胞誘導的神經細胞培養(yǎng)在3D環(huán)境下，對于化合物篩選和疾病模型建立有較大的潛力。3D培養(yǎng)被認為是最接近人體組織的體外培養(yǎng)方法，無論是結構、細胞生長特點及細胞與細胞和細胞與基質之間的相互作用，都很好的模擬了體內環(huán)境。本篇說明介紹了一個新的神經退行性疾病和神經毒性篩選的方法，應用iPSC誘導的神經細胞在OrganoPlate®高通量微流控平臺上進行3D水平上的神經突觸檢OrganoPlate®是一個結合了最新3D培養(yǎng)技術和微流控技術的高通量篩選平臺，基于96孔組織芯片，可以做長時間活細胞檢測，滿足篩選需要，并且兼容常用實驗室設備和自動化系統(tǒng)，如ImageXpress® MicroConfocal高內涵成像和分析系統(tǒng)。
材料：
• OrganoPlate® 板 (MIMETAS)
• 人iPSC誘導的神經細胞iCell® Neurons(Cellular Dynamics International)
• 神經細胞培養(yǎng)基(Cellular DynamicsInternational)
• Matrigel (Corning)
• Calcein AM (Life Technologies)
• MitoTracker Orange(Life Technologies)
• Hoechst (Life Technologies)
• Saponin (Sigma)
• PBS (Sigma)
• Αντι-β-tubulin III (TUJ-1) 抗體(BDBiosciences)
• ImageXpress Micro Confocal 共聚焦高內涵成像和分析系統(tǒng) (MolecularDevices)
• MetaXpress高內涵成像和分析軟件6.2(Molecular Devices)
在3D膠中形成神經網絡：
細胞培養(yǎng)、化合物處理和細胞染色步驟依照微流控操作說明。對3D膠中神經細胞的表型變化和細胞活力的評價采用共聚焦成像模式。人iPSC誘導的神經細胞與Matrigel膠混合，膠的終濃度為7mg/mL，并以30,000細胞每微孔槽的濃度加入OrganoPlate®板中。在種板的時候，膠和細胞的混懸液需放置于冰上以防止Matrigel膠凝固。根據(jù)膠的濃度和細胞濃度調整加入一個微流控孔道中的體積在1-1.4μL之間。種板后，將微流控板放置于37°C 5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育30分鐘，使膠凝固。然后，向微流控通道的入口和出口分別加入50μL培養(yǎng)基，再放入培養(yǎng)箱中。24小時后形成神經突觸，可一直培養(yǎng)至14天。為評估OrganoPlate微流控板研究神經毒性和神經元發(fā)育的可行性，選取了幾種已知的神經突觸抑制劑處理神經元。細胞在培養(yǎng)24小時后加入化合物，繼續(xù)培養(yǎng)5天，并每兩天更換一次含有化合物的培養(yǎng)基，并且化合物以合適的梯度加入微流控孔中。神經網絡的形成通過透射光進行實時監(jiān)測，為評價神經細胞活力向細胞中加入三種活細胞染料的混合液：活細胞染料鈣黃綠素(1μM)，線粒體膜電位染MitoTrackerOrange(1 μM)，和細胞核染料Hoechst(1μM)�；旌先玖媳患尤胛⒘骺匦酒椎乐�，孵育60分鐘后用培養(yǎng)基洗掉�；蛘�，細胞被4%多聚甲醛固定后加入0.01%皂素進行細胞膜通透，用1:100稀釋的神經元標記物β-tubulin III (TUJ-1)一抗和熒光二抗染色，Hoechst染細胞核。一抗孵育需要4°C過夜。
3D培養(yǎng)的表型分析：
高內涵成像和分析系統(tǒng)被用于評價化合物對神經網絡的影響。為更好的研究3D膠中的神經細胞活力和突觸生長，我們優(yōu)化了共聚焦成像模式和分析方法。神經細胞圖像由ImageXpress Micro Confocal共聚焦高內涵系統(tǒng)獲取，采用了10x、20x和40x物鏡，并在聚焦面的上下拍攝一個Z軸序列(圖1)。17-30層，層間距為3-10μm的圖像被采集，包含大約150-300μm厚度。所有圖片被保存，并被用于進一步的3D分析和2D透射分析(Maximum透射或BestFocus)。
3D培養(yǎng)的表型分析：
高內涵成像和分析系統(tǒng)被用于評價化合物對神經網絡的影響。為更好的研究3D膠中的神經細胞活力和突觸生長，我們優(yōu)化了共聚焦成像模式和分析方法。神經細胞圖像由ImageXpress Micro Confocal共聚焦高內涵系統(tǒng)獲取，采用了10x、20x和40x物鏡，并在聚焦面的上下拍攝一個Z軸序列(圖1)。17-30層，層間距為3-10μm的圖像被采集，包含大約150-300μm厚度。所有圖片被保存，并被用于進一步的3D分析和2D透射分析(Maximum透射或BestFocus)。
Maximum透射2D圖像分析：
應用MetaXpress®高內涵圖像采集和分析軟件進行圖像分析。全自動的對圖像進行定量分析使用的兩種方法：做透射后進行2D分析和Z-stack的3D水平分析。對2D透射圖像分析， Z - s t a c k 序列圖像進行Maximum透射，然后用軟件預置的神經突觸分析模塊進行分析。輸出的評價不同時間點細胞表型及神經網絡復雜程度的參數(shù)包括：突觸總長度、突觸個數(shù)、細胞數(shù)和細胞活力。透射光的圖像用Best Focus算法進行2D透射后進行分析。2D圖像的分析速度快，可精確的評價神經網絡的程度。但是，2D分析有一定的局限性，這種方法無法計算如體積這樣的參數(shù)，并且得到的只是單層的結果。圖2和3所示為熒光合成圖，對照組和魚藤酮處理組圖片被神經突觸模塊分析后的mask圖片。分析參數(shù)包括：突觸總長度、突觸個數(shù)和細胞總個數(shù)(細胞體)。圖4顯示了神經突觸長度、突觸個數(shù)和細胞活力的隨化合物的處理而減少，神經毒性化合物包括：磷酸三苯酯、四乙基秋蘭姆、六氯酚、魚藤酮和甲基汞(均為10μM)。
3D可視化和3D圖像分析：
MetaXpress軟件可以將Z軸序列圖像重構成3維立體結構觀察細胞核及細胞網絡，并進行3D水平的分析。圖像應用用戶自定義的3D分析中“findfibers”功能，“fibers”數(shù)值評價神經突觸；同時計算了細胞個數(shù)。計算對象首先在每層中識別出，然后使用“connect bybest match”功能將其在3D空間中連接起來。3D分析使突觸計算更準確，是一個評估神經連接等更好的方法。3D分析得到的參數(shù)包括突觸個數(shù)、細胞體積、總突觸體積、分支個數(shù)和節(jié)點數(shù)。細胞總個數(shù)是通過在Hoechst染色通道識別“sphericalb j e c t s ” 。圖5 所示為分析識別“fibers”和“nuclei”的蒙板。另一個用戶自定義模塊分析細胞活力特征(鈣黃綠素陽性的胞體)和線粒體完整性(MitoTracker Orange陽性的胞體)。細胞分類分析可以得到活細胞個數(shù)(鈣黃綠素陽性的胞體)和有完整線粒體的細胞個數(shù)(MitoTracker Orange陽性)。計算結果包括細胞個數(shù)(total nuclei)，活細胞個數(shù)(Calcein AM positive)，以及細胞體積和熒光強度。圖5B和5C所示為“Calcein AMpositive cytoplasm”，“MitoTracker positive cytoplasm” 和 “nuclei”的識別蒙板。圖6顯示了化合物影響神經網絡的幾個特征參數(shù)： 突觸個數(shù)的減少(fibers)，節(jié)點個數(shù)，以及活細胞個數(shù)和完
整線粒體的細胞個數(shù)。
應用OrganoPlates做神經毒性的3D分析：
表型分析包括在程度和復雜性上定量3D分析神經網絡，得到多個參數(shù)。在這個神經模型系統(tǒng)里，我們評估了模型的重復性、多參數(shù)，并檢測了多個已知的神經毒性化合物。通過這些分析方法，我們準確得到了化合物對復雜神經網絡的濃度依賴的抑制作用曲線。因此驗證了此模型可以用于高通量的多參數(shù)的預測化合物的神經毒性。
結論：
我們建立了一個可定量的共聚焦高內涵成像方法， 結合使用M I M E T A SOrganoPlates，對化合物影響神經細胞活力和形狀進行高通量的3D表型分析。共聚焦成像和多參數(shù)3D分析模塊提供了一個在3D水平上計算和統(tǒng)計神經細胞個數(shù)和突觸特征的方法。3D分析結果可計算出化合物對神經細胞影響的EC50值，幫助篩選出毒性化合物。
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