Leica DLS光片成像模塊升級共聚焦顯微鏡:成像更快速，光毒性更低
對生物樣品進行快速可靠的原位成像以揭示與復雜的多細胞生物相關的動態(tài)過程一直都是光學成像的一大目標。傳統(tǒng)的激光共聚焦顯微鏡雖然具有優(yōu)異的3D熒光成像功能，提供了非常高的空間分辨率，但是在某些實驗中，成像速度不夠快和光漂白問題依然不容忽視。光片技術的提出就很好地解決了這些問題，同時還保有優(yōu)異的空間分辨率。
Leica DLS 光片成像模塊可直接搭建在共聚焦顯微鏡之上，為共聚焦系統(tǒng)升級新技能：快速3D成像、更低光毒性、光操作和活體快速3D成像結合。
Leica光片顯微系統(tǒng)常見應用：
·三維細胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、器官培養(yǎng)的實時成像。
·結合共聚焦或雙光子激光顯微鏡，完成光學刺激與追蹤的功能，觀察和實驗方式更為靈活多樣。
1.快速3D成像
左：海藻3D重構+拼圖，自發(fā)熒光
右：果蠅眼睛3D重構
2.活體快速長時間3D成像，捕捉整個動態(tài)過程
斑馬魚心臟跳動3D重構
3.唯一可以結合共聚焦和光片的系統(tǒng)，實現(xiàn)光學操作的后續(xù)追蹤
斑馬魚神經(jīng)元轉換（Kaede）后，持續(xù)記錄該細胞的運動，視頻如下所示
追蹤根內生真菌Piriformospora indica的生長過程【1】
追蹤真菌的生長和生物膜的形成在食品和制藥行業(yè)有著重大意義：了解真菌生長的模式和機制，可以幫助我們更有效地利用有益真菌、遏制有害菌。真菌在不同發(fā)育時期的生長情況依賴于胞內活動和所處的生化環(huán)境。但是目前常用的共聚焦顯微鏡和電鏡技術并不能完美地完成這個任務。
發(fā)表于ChemPhysChem的《Exploring Morphological and Biochemical Linkages in Fungal Growth with Label-Free Light Sheet Microscopy and Raman Spectroscopy》采用Leica光片技術DLS，直接利用真菌本身的自發(fā)熒光：由于代謝狀態(tài)不同，這個自發(fā)熒光“特異性標記”在孢子上，而菌絲基本沒有。從圖可以看到利用DLS，明顯看到孢子的分布規(guī)律：朝向頂端，呈梯度分布，離頂端越近孢子密度越大。成像深度達1.1mm，完全滿足對完整真菌的研究。這個梯度分布表明真菌存在內部的生長調節(jié)機制。再結合表面增強拉曼光譜技術（Surface-Enhanced Raman Spectroscopy ( SERS)），將復雜的物理化學作用與真菌生長的形態(tài)學特征直接關聯(lián)起來，為次級代謝產(chǎn)物與真菌生長關系的研究提供了一個很好的工具。
Leica光片成像原理
我們先來看看什么是光片顯微技術【2】：
使用一層光束從樣品側面激發(fā)熒光樣品，使用CCD或sCMOS進行檢測，照明光路和熒光檢測光路互相垂直。由于樣品受激發(fā)的平面就是成像平面，不存在離焦激發(fā)，可以自動獲得光學切片，從而將光漂白和光學損傷降到最低。光片顯微系統(tǒng)使用CCD或sCMOS成像，速度通常為每秒幾十幀，甚至上百幀，所以通過在光片下移動樣品使入射光束激發(fā)不同的平面，可以很容易又非常快速的得到整個組織的3D圖。
那我們也會發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的光片顯微鏡通常需要在獨立系統(tǒng)中安裝專用的光學裝置，其中照明和檢測物鏡相互垂直布置�？墒窃趯嶋H應用中很多時候我們既需要光片又需要共聚焦功能。
Leica TCS SP8 DLS創(chuàng)造性地將光片成像和共聚焦成像結合在一起：光片直接搭建在共聚焦平臺上，獨特的 TwinFlect 反光鏡裝置使激發(fā)光束從左右兩個方向入射到樣品上，照明均勻，且天然的雙側照明消除昏暗區(qū)域干擾保證了細胞水平的分辨率。成像速度快、分辨率高和光毒性低的特點可使樣品在該系統(tǒng)中保持其生物活性，完成數(shù)小時乃至數(shù)天的長時間活體生物培養(yǎng)及成像。
光片顯微鏡變得前所未有的簡便，同時又不犧牲共聚焦功能，還可以實現(xiàn)光片與共聚焦顯微鏡的聯(lián)合使用，完成光激活、光轉換等操作及后續(xù)追蹤的實驗。
參考文獻
【1】Siddhanta,S., et al. (2017). "Exploring Morphological and Biochemical Linkages in Fungal Growth with Label-Free Light Sheet Microscopy and Raman Spectroscopy." Chemphyschem 18(1): 72-78.
【2】Huisken, J., et al. (2004). "Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy." Science 305(5686): 1007-1009.
