簡介

轉(zhuǎn)基因煙草是一種新型的單克隆抗體（mAb）表達系統(tǒng)，與傳統(tǒng)重組哺乳動物或細菌細胞系相比，其不易受動物源性病原體、毒素或病毒的污染，即更安全，且轉(zhuǎn)基因煙草源性重組蛋白具有與哺乳動物蛋白相似的糖基化模式，構(gòu)建也相對簡單。但轉(zhuǎn)基因煙草表達獲得的抗體滴度一般較低，且包含多糖、葉綠素、生物堿、纖維素及天然蛋白等各種可與層析介質(zhì)非特異性吸附的雜質(zhì)，導致下游純化難以高效進行。本實驗使用兩步級聯(lián)式中空纖維超濾作為濃縮和預純化步驟，降低層析操作負載，從而提高純化工藝的整體效率。

實驗 & 結(jié)果

實驗構(gòu)建表達抗綠膿假單胞菌抗體的轉(zhuǎn)基因煙草植株，抗體分子量152.6kD。煙葉粉碎后，加入磷酸鹽緩沖液均質(zhì)，紗布過濾去除大粒徑植物性雜質(zhì)，濾液高速連續(xù)流離心，獲得的上清液用0.2μm CellFlo Plus中空纖維組件（產(chǎn)品編號：C72M-061-01N）微濾去除較小粒徑植物成分（平均流速6.4L/m2/h，剪切<800S-1），濾液使用50kD（產(chǎn)品編號：M25S-100-01S，膜表面積：1050cm2）及100kD（產(chǎn)品編號：X2AB-300-02N，膜表面積：145cm2） MiniKros中空纖維組件進行兩步級聯(lián)超濾（流路構(gòu)建見圖，平均流速19L/m2/h，剪切<1800 S-1），將8.4L料液濃縮至0.2L，成功去除~97%的植物源性雜質(zhì)，并保證mAb的完整回收（~100%），抗體滴度提高達32倍。濃縮液使用50kD組件以磷酸鈉緩沖液進行10體積洗濾后，先后進行陽離子交換層析和Protein A親和層析。獲得的純化mAb進行體積排阻層析、SDS-PAGE及ELISA分析。獲得的重組人抗體純度高于95%，總回收率達50%。

兩步級聯(lián)超濾流路圖：M1-50kD中空纖維組件；M2-100kD中空纖維組件；Pf-Cole-Parmer Masterflex進樣泵；Pp-Thomas Welch vacuum濾液泵；Pr-Cole-Parmer ISMATEC回流泵；PD-脈沖阻尼器，用于穩(wěn)定系統(tǒng)內(nèi)液流；系統(tǒng)同時監(jiān)測各組件入口及濾液壓力，并在不同位置設置分流閥。

討論

結(jié)果顯示，使用50及100kD中空纖維組件進行兩步級聯(lián)濃縮-洗濾，可顯著降低料液雜質(zhì)含量，并提高產(chǎn)物濃縮，減輕后續(xù)層析步驟負載。與PEG/PEI沉淀法相比，該技術不會引入額外的添加劑，且選擇性高；與直接層析法相比，預過濾提高了層析進樣的純度和濃度，有助于優(yōu)化層析設備的利用率，降低成本。該方法溫和且易于工藝放大，適用于煙草源性抗體的大規(guī)模純化。

本文內(nèi)容為編者翻譯，如有不當之處，敬請諒解，詳細內(nèi)容，請參考原文。

原文：Mayani, M., Filipe, C.D.M., Mclean, M.D., et al., Purification of transgenic tobacco-derived recombinant human monoclonal antibody. Biochemical Engineering Journal, 2013, 72: 33-41.

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