背景/介紹

抗體（Abs），或免疫球蛋白（Ig），被廣泛用于許多不同的科研和治療性應(yīng)用¹。特別是，單克隆抗體（mAbs）在診斷、蛋白質(zhì)純化以及醫(yī)療應(yīng)用中的使用顯著增加^2-5。妨礙治療性mAbs使用的一個主要障礙是皮下注射需要使用較高的濃度，因為這是優(yōu)先選擇的給藥方法。按FDA要求，皮下給藥時，注射體積應(yīng)低于1.5ml，這就意味著，制劑的濃度需高于100mg/ml⁷。但是，如此高濃度的mAb制劑對生產(chǎn)來說會是不小的挑戰(zhàn)，問題包括穩(wěn)定性、溶解性、高粘度以及聚集^8,9。Ab制劑也會有相似的問題。

相比平板膜包過濾器，中空纖維切向流過濾（HF TFF）是高濃度Abs制劑制備的一種極佳的方法，因為纖維內(nèi)腔呈現(xiàn)非湍流的流體動力學(xué)，獲得顯著更低的壓力降。對于大多數(shù)使用膜包式TFF過濾器的高濃度Ab應(yīng)用，需降低進樣泵，以維持恒定的壓力，因為抗體的粘度會不斷增加。在HF TFF中，不需要控制進樣泵，因為壓力增加非常小。此外，使用HF 過濾器時，產(chǎn)物的收獲和排空也非常簡單，因其沒有膜包過濾器通常使用的湍流促進器或篩網(wǎng)。最后，使用一次性HF 過濾器可免去繁瑣的清洗、組裝、拆裝和維護步驟，最終節(jié)省傳統(tǒng)膜包過濾器使用相關(guān)的時間和間接成本。

本應(yīng)用測試了使用HF膜進行IgG有效濃縮的可行性，并分析了剪切率和跨膜壓（TMP）對濾液通量的影響。

材料和方法

系統(tǒng)：KR2i TFF系統(tǒng)（SYR2-U20，SpectrumLabs.com）

過濾器：30kDa mPES，MicroKros（C02-E030-05-N，0.5mm；C02-E030-10-N，1.0mm，SpectrumLabs.com）

樣品準(zhǔn)備

IgG為商業(yè)化產(chǎn)品（Sigma Aldrich），溶解于0.9%鹽溶液，至終濃度30mg/mL。實驗運行前，溶液使用0.2μm過濾器過濾，去除較大的顆粒。

IgG起始和終濃度使用280nm吸光光度法檢測，使用Beer法則計算濃度。ε280=210,000M^-1cm^-1。

過濾器組件準(zhǔn)備

濃縮實驗前，過濾器組件潤濕，并測試完整性。MicroKros過濾器組件截留分子量（MWCO）為30kDa，含改性聚醚砜（mPES）纖維，在本應(yīng)用筆記中，實驗使用纖維內(nèi)徑（ID）為0.5mm（每根組件含6根纖維，20cm²）或1.0mm（每根組件含2根纖維，13cm²）的組件。組件潤濕及完整性測試使用KR2i TFF系統(tǒng)進行。簡單來說，過濾器組件用DI水沖洗，直至每cm2表面積濾液體積為2ml。使用泄漏實驗，測試?yán)w維和組件完整性。組件完全潤濕，纖維外腔（ECS）用水完全浸沒。回流端關(guān)閉，通過入口，向組件內(nèi)緩慢導(dǎo)入空氣。當(dāng)跨膜壓（TMP）達到~0.5psi時，停泵。ECS內(nèi)無氣泡，且進樣壓力恒定，說明為完整過濾器組件。完整性檢查后，使用0.9%鹽溶液潤洗過濾器，直到收集到2mL/cm²的濾液。

濃縮實驗

濃縮實驗使用KR2i TFF系統(tǒng)進行。實驗使用纖維內(nèi)徑0.5和1.0mm的HF膜，剪切為6,000S^-1。使用整合式KF Comm軟件采集數(shù)據(jù)（流速、壓力等）。IgG溶液（30mg/mL）加入錐底容器（含3導(dǎo)管蓋，SpectrumLabs.com）。濾液管路連接至收集容器。濃縮過程通過測量收集的濾液的質(zhì)量來監(jiān)測，由KF Comm軟件自動檢測。在3秒鐘內(nèi)，緩慢增加泵速，至所需流速（6,000S^-1剪切），將蛋白溶液泵入組件。KR2i系統(tǒng)設(shè)置為濃縮（C）模式。

剪切率實驗

為測試不同剪切率對濾液通量的影響，將IgG溶液（~100mg/mL）循環(huán)通過HF膜。為保證整個工藝過程中，IgG濃度恒定，IgG溶液用0.9%鹽溶液連續(xù)洗濾。系統(tǒng)設(shè)置與C模式一致，但將錐底樣品容器的第3根導(dǎo)管連接至裝有緩沖液的輔助容器，而不是連通空氣。流路通過工藝過程中形成的真空，向IgG溶液中連續(xù)添加緩沖液，速度與濾液流速一致。剪切率實驗以可提供適當(dāng)剪切率的流速進行，不施加背壓。實驗使用含0.5和1.0mm內(nèi)徑HF膜的過濾器組件進行，數(shù)據(jù)采集使用KF Comm軟件。

跨膜壓（TMP）實驗

通過在恒定剪切率條件下，向回流管路施加背壓，測試跨膜壓（TMP）對過濾器性能的影響。實驗使用含0.5和1.0mm內(nèi)徑HF膜的MicroKros過濾器組件進行。實驗使用剪切率6,000和10,000S^-1。實驗設(shè)置與剪切率實驗相似，只有一個需要注明的不同。按濃縮/洗濾（C/D）模式，使用一個二級洗濾泵向蛋白溶液中連續(xù)補加緩沖液（0.9%鹽），以在整個實驗過程中，維持恒定的30mg/mL的IgG濃度（濃縮因子設(shè)置為1，以使洗濾立即開始）。數(shù)據(jù)使用KF Comm軟件采集。

結(jié)果和討論

濃縮實驗（0.5mm內(nèi)徑）

起始實驗中，我們使用HF膜測試了IgG可被濃縮的最大限度。使用含0.5mm內(nèi)徑纖維的MicroKros組件。實驗中，將20mL 30mg/mL的IgG溶液（0.9%鹽溶液）置于50mL含3導(dǎo)管蓋的錐底工藝容器中。2根導(dǎo)管分別連接至組件的進樣和回流管路，第3根導(dǎo)管連通空氣。

濾液管路關(guān)閉，IgG溶液緩慢泵入管路和組件。當(dāng)循環(huán)流速恒定后，打開濾液管路，開始濃縮。在此實驗中，不施加外部背壓（通過回流管路），所以，隨溶液濃度增加而導(dǎo)致的粘度的增加，TMP增加。進樣流速27mL/min（6,000S^-1剪切）也保持恒定。

圖1.使用含0.5mmID mPES HF 膜的MicroKros組件進行高度濃縮實驗時的通量、TMP、壓力降（DP）和濃縮因子（CF）數(shù)據(jù)。

如圖1所示，濃縮開始后，TMP立即開始增加。同時，通量開始穩(wěn)定下降。組件兩端的壓力降（DP）可作為膜污染的指示，通常是涉及濃縮步驟的工藝的困擾。但是，圖1顯示，即使在工藝開始60min后，壓力降維持在10psig以下。60min之后，壓力降開始增加超過10psig，最終達到約25psig，通量降至0L/m²/hr。

使用UV-分光光度法確定IgG溶液的最終濃度，約為350mg/mL，相當(dāng)于濃縮~12x。

濃縮實驗（1.0mm內(nèi)徑）

我們也使用含1.0mm纖維內(nèi)徑HF膜的過濾器組件進行了濃縮實驗。該工藝的剪切率保持恒定，為6,000S^-1（71mL/min。）TMP通過自動背壓閥控制，維持為5psig。結(jié)果如圖2所示。

圖2. 使用含1.0mm ID mPES HF膜的MicroKros組件進行濃縮運行時的通量、TMP、DP和CF數(shù)據(jù)。運行過程中TMP保持恒定為5psig（除最后數(shù)據(jù)點）。

如圖2所示，1.0mm內(nèi)徑纖維的起始通量高于0.5mm內(nèi)徑纖維（18L/m²/hr vs. 12L/m²/hr）。正如預(yù)期，通量隨IgG溶液濃度的增加而降低。運行過程中，TMP恒定為5psig，直到接近運行結(jié)束時，增加至約10psig。此時，通量降低至0L/m²/hr。圖2同時顯示，在整個運行過程中，總壓力降低于8psig，說明膜污染較低。這表明，1.0mm纖維在濃縮過程中，可獲得更好的過濾器通量。

使用UV分光光度法檢測IgG終溶液的濃度，計算為約226mg/mL，濃縮7.5倍。使用1.0mm內(nèi)徑纖維需要使用更大的管路，以達到71mL/min的流速。由于滯留體積的增加，不能獲得高于250mg/mL的濃度。但是，在優(yōu)化的條件下，可獲得更高的濃度。

剪切率實驗

由于使用HF膜進行IgG濃縮時的壓力降更低，所以可使用更高的進樣流速/剪切率，縮短處理時間。為檢測剪切率對濾液流速的影響，將IgG溶液（~100mg/mL）在逐步增加的進樣流速/剪切率條件下循環(huán)。實驗運行不施加背壓。

對0.5mm（圖3）和1.0mm（圖4）纖維，提高剪切率，可增加濾液通量。如圖3所示，濾液通量隨剪切率提高而線性增加，剪切率從4,000S^-1升至12,000S^-1時，通量分別從6L/m²/hr增加至10L/m²/hr。但是，需要注意的是，即使不施加背壓，在最低剪切率條件下（4,000S^-1），最低TMP仍有5psig。當(dāng)剪切率增加至12,000S^-1時，TMP增加至約20psig。

與0.5mm內(nèi)徑HF膜，1.0mm內(nèi)徑HF膜過濾器組件顯示濾液通量顯著增加，同時跨膜壓有較大降低。圖4顯示，濾液通量增加4倍，從4L/m²/hr增加至16L/m²/hr。重要的是，跨膜壓基本保持不變，即使在11,000S^-1剪切率時，也不會增加超過5psig。而在TMP 為5psig時，0.5mm內(nèi)徑纖維只能獲得約6L/m²/hr的濾液通量。

圖4. 使用1.0mm ID HF膜時，提高剪切率對濾液通量的影響。

TMP實驗

在我們最后的實驗中，我們測試了在給定剪切率條件下，施加背壓對過濾器性能的影響。在此實驗中，在6,000和10,000S^-1剪切率條件下，對含有0.5和1.0mm內(nèi)徑纖維的過濾器組件進行測試，而TMP從5增加至20psig。結(jié)果如圖5和圖6所示。實驗使用30mg/mL IgG溶液（0.9%鹽溶液）進行。

如圖5所示，增加背壓對濾液通量會有負作用，使用含0.5mm內(nèi)徑纖維過濾組件，剪切率為6,000S^-1時，通量從14L/m²/hr降低至9L/m²/hr。這說明提高背壓會增加凝膠層的形成，最終降低過濾器性能。有意思的是，當(dāng)剪切率增加至10,000S^-1，且TMP恢復(fù)至5psig，濾液通量增加至18L/m²/hr，這說明增加的流速可從膜表面清掃并去除沉降的IgG。此外，將TMP增加至10、15和20psig，對濾液通量不會有不利的影響，說明在10,000S^-1下，增加的剪切率可有效且連續(xù)地沖掃膜表面。而即使在較高的TMP條件下，這種沖掃作用防止了凝膠層的形成。

圖5.通過背壓提高TMP時，對0.5mm內(nèi)徑HF膜的影響。

圖6所示為使用含1.0mm內(nèi)徑纖維過濾器組件時，進行的一致的實驗的結(jié)果�？梢�，在剪切6,000或10,000S-¹時，濾液通量不會隨TMP的增加而降低。在所有測試的TMP條件下，剪切率為6,000S^-1時，通量維持約為15L/m²/hr。剪切率為10,000S^-1時，當(dāng)TMP從5增加至20psig，通量從20稍微提高至23L/m²/hr。

圖6. 通過背壓提高TMP時，對1.0mm內(nèi)徑HF膜的影響。

總結(jié)

這里，我們描述了使用含0.5和1.0mm內(nèi)徑纖維的HF 過濾器組件進行IgG濃縮的工藝。本應(yīng)用筆記顯示，使用Spectrumlabs.com的HF膜，IgG濃度可濃縮至350mg/mL。此外，我們發(fā)現(xiàn)，0.5和1.0mm內(nèi)徑膜在此實驗中，存在性能差異。

這些實驗顯示，含1.0mm內(nèi)徑纖維的過濾器組件更適合Abs的濃縮。使用1.0mm內(nèi)徑纖維可獲得更低的壓力降和更高的通量，從而縮短處理時間。

同時，我們發(fā)現(xiàn)，對工藝施加背壓不會顯著提高濾液通量。在某些情況下，背壓會降低濾液通量。當(dāng)然，每一個工藝都需要其自身的一系列實驗，以優(yōu)化參數(shù)，但這些結(jié)果可作為一個良好的起始點（如6,000-8,000S^-1，不施加背壓）。

總結(jié)來說，使用SpectrumLabs.com的HF膜，可快速、溫和、穩(wěn)定地獲得高Ab濃度，從根本上降低產(chǎn)物損失。此外，由于HF過濾器組件的幾何結(jié)構(gòu)和排空能力，產(chǎn)物隔離保持在較高水平，進一步提高了產(chǎn)物的收率。綜合這些IgG實驗結(jié)果，相似的工藝可用于mAbs的純化。

參考文獻：

1. Lipman,N.S.; Jackson, L.R.; Trudel,L.J.; Weis-Garcia, F.ILAR Journal 2005,46,258.
2. Weiner,L.M.; Surana,R.; Wang,S. Nat Rev Immunol 2010,10,317.
3. Weiner,G.J. Nat Rev Cancer 2015,15,361.
4. Levy,N.E.; Valente,K.N.; Choe,L.H.; Lee,K.H.; Lenhoff,A.M. Biotechnology and Bioengineering 2014,111,904.
5. Ecker,D.M.; Jones,S.D.; Levine,H.L. mAbs 2015,7,9.
6. Shire,S.J.; Shahrokh,Z.; Liu,J. Journal of Pharmaceutical Sciences,93,1390.
7. Neergaard,M.S.; Nielsen,A.D.; Parshad,H.; De Weert,M.V. Journal of Pharmaceutical Sciences 2014,103,115.
8. Shire,S.J.; In Monoclonal Antibodies; Woodhead Publishing: 2015 p93.
9. Shire,S.J.; In Monocolnal Antibodies; Woodhead Publishing: 2015 p139.

掃描二維碼，關(guān)注仕必純微信公眾號，獲取更多應(yīng)用信息！