一．配膠

1． 注意一定要將玻璃板洗凈，最后用ddH2O沖洗，將與膠接觸的一面向下傾斜置于干凈的紙巾晾干。

2． 分離膠及濃縮膠均可事先配好（除AP及TEMED外），過濾后作為儲存液避光存放于4℃，可至少存放1個月，臨用前取出室溫平衡（否則凝膠過程產(chǎn)生的熱量會使低溫時溶解于儲存液中的氣體析出而導致氣泡，有條件者可真空抽吸3分鐘），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分離膠濃度越高AP濃度越低，15%的分離膠可用到0.5:100）及TEMED（分離膠用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，濃縮膠用0.8：1000）即可

3． 封膠：灌入2/3的分離膠后應立即封膠，膠濃度＜10%時可用0.1%的SDS封，濃度＞10%時用水飽和的異丁醇或異戊醇，也可以用0.1%的SDS。封膠后切記，勿動。待膠凝后將封膠液倒掉，如用醇封膠需用大量清水及ddH2O沖洗干凈，然后加少量0.1%的SDS，目的是通過降低張力清除殘留水滴。

4．灌好濃縮膠后1h拔除梳子，注意在拔除梳子時宜邊加水邊拔，以免有氣泡進入梳孔使梳孔變形。撥出梳子后用ddH2O沖洗膠孔兩遍以去除殘膠，隨后用0.1%的SDS封膠。若上樣孔有變形，可用適當粗細的針頭撥正；若變形嚴重，可在去除殘膠后用較薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min后即可上樣，長時間有利于膠結(jié)構(gòu)的形成，因為肉眼觀的膠凝時其內(nèi)部分子的排列尚未完成。

 

二．樣品處理

1．培養(yǎng)的細胞（定性）：

⑴ 去培養(yǎng)液后用溫的PBS沖洗2~3遍（冷的PBS有可能使細胞脫落）。

⑵ 對于6孔板來說每孔加200~300μl，60~80℃的1×loading buffer。

⑶ 100℃，1min。

⑷ 用細胞刮刮下細胞后在EP管中煮沸10min，期間vortex 2~3次。

⑸ 用干凈的針尖挑絲，如有團塊則將團塊棄掉，如果沒有團塊但有拉絲現(xiàn)象，則可以將EP管置于0℃后在14000~16000g離心2min，再次挑絲。若無團塊也無絲狀物但溶液有些粘稠，可通過使用1ml注射器反復抽吸來降低溶液粘滯度，便于上樣。

⑹ 待樣品恢復到室溫后上樣。

2．培養(yǎng)的細胞（定量）：

⑴ 去培養(yǎng)液后用溫的PBS沖洗2~3遍（冷的PBS有可能使細胞脫落）。

⑵ 加入適量的冰預冷的裂解液后置于冰上10~20min。

⑶ 用細胞刮刮下細胞，收集在EP管后超聲（100~200w）3s，2次。

⑷ 12000g離心，4℃，2min。

⑸ 取少量上清進行定量。

⑹ 將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上樣最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低溫儲存，-70℃一個月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上樣前98℃，3min。

3．組織：

⑴ 勻漿 對于心肝脾腎等組織可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液�？墒謩踊螂妱觿驖{。注意盡量保持低溫，快速勻漿。

⑵ 12000g離心，4℃，2min。

⑶ 取少量上清進行定量。

⑷ 將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上樣最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低溫儲存，-70℃一個月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上樣前98℃，3min。

 

三．電泳

1．上樣前將膠板下的氣泡趕走。

2．所有蛋白樣品調(diào)至等濃度后上樣，樣品兩側(cè)的泳道用等體積的1×loading buffer上樣，Marker也用1×loading buffer調(diào)整至與樣品等體積。

2．以初始電壓為45V時的電流強度進行穩(wěn)流電泳，當電壓達65V時改為穩(wěn)壓電泳。

3．在目的蛋白泳動至距膠下緣1cm以上結(jié)束。

 

四．轉(zhuǎn)膜

1．電泳結(jié)束前20分鐘左右戴上手套開始準備：

濕轉(zhuǎn)使用常規(guī)電轉(zhuǎn)液：Tris 3.0g，Gly 14.4g， M-OH 200ml，加去離子水至1,000ml。干轉(zhuǎn)則取此轉(zhuǎn)移液，每50ml加入10%SDS180ul。

浸泡NC膜：將NC膜平鋪于去離子水面，靠毛細作用自然吸水后再完全浸入水中10min以排除氣泡，隨后浸泡入轉(zhuǎn)移液中。PVDF膜則在M-OH中浸泡20min以上后轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)移液中。將濾紙也浸入轉(zhuǎn)移液中。

2．取膠：

將膠卸下，保留30-100KD或分子量范圍更廣些的膠（以便以后雜其他感興趣的蛋白），左上切角，在轉(zhuǎn)移液中稍稍浸泡一下，置于潔凈玻璃板上，按順序鋪上膜與每側(cè)一張（干轉(zhuǎn)每側(cè)三張）濾紙。注意用玻棒逐出氣泡，剪去濾紙與膜的過多部分（尤其是干轉(zhuǎn)，以防止短路）

3．轉(zhuǎn)膜：

濕轉(zhuǎn)：電轉(zhuǎn)槽用去離子水淋洗晾干，加入1,000ml電轉(zhuǎn)液。將膠平鋪于海綿上，滴加少許電轉(zhuǎn)液再次驅(qū)趕氣泡，封緊后放入電轉(zhuǎn)槽，注意膜在正極一側(cè)。降溫，將電泳槽置于冰水混合物中。恒流100mA過夜，或400mA，4h。注意不同蛋白的要求不同。

干轉(zhuǎn)：用電轉(zhuǎn)液淋洗石墨電極，濾紙吸干，鋪上膠，再滴少許電轉(zhuǎn)液，以1.5mA/cm2凝膠面積轉(zhuǎn)移1-2小時。負載電壓不宜超過1V/cm2膠面積。

 

五．封閉及雜交

1．封閉：

將膜從電轉(zhuǎn)槽中取出，去離子水與PBST或TTBS稍加漂洗，浸沒于封閉液中緩慢搖蕩一小時。必要時可先用麗春紅染色（2%乙酸，0.5%麗春紅的水溶液）觀察蛋白條帶，再用去離子水和TTBS將麗春紅洗脫后封閉，如用蛋白marker則可省略此步。

2．結(jié)合一抗：

一抗的準備：使用反貼法時每張3×9cm2膜約需2ml一抗稀釋液。

反貼法的操作：含一抗的封閉液滴加于搖床的塑料膜上，將Western膜從封閉液中取出，濾紙貼角稍吸干，正面朝下貼在一抗上，注意不要留下氣泡，室溫下輕搖孵育一小時或4℃靜置過夜。在反應體系外面罩一濕潤平皿以防止液體過多蒸發(fā)。

3．洗滌：

一抗孵育結(jié)束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。

4．結(jié)合二抗：

根據(jù)一抗來源選擇合適的二抗，根據(jù)鑒定方法選擇HRP或AP標記的抗體，按相應比例稀釋（1:1000~1:10000），室溫輕搖一小時。

5．洗滌：

二抗孵育結(jié)束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。

 

六．發(fā)光鑒定

一般使用辣根過氧化物酶HRP-ECL發(fā)光法或堿性磷酸酶AP-NBT/BICP顯色法。

1．HRP-ECL發(fā)光法：

將A、B發(fā)光液按比例稀釋混合。膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于A、B混合液滴上，熄燈至可見淡綠色熒光條帶（5min左右）后濾紙貼角吸干，置于保鮮膜內(nèi)固定于片盒中，迅速蓋上膠片，關(guān)閉膠盒，根據(jù)所見熒光強度曝光。取出膠片立即完全浸入顯影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水沖凈晾干，標定Marker，進行分析與掃描。

2．AP-NBT/BICP顯色法：

每片NBT/BICP可溶解于30ml水中，使用前將一片分裝在30個 EP管中，每張3×9cm的膜取一管配成1ml即可。將PBST或TTBS洗滌過的膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物體（如報紙）遮擋光線，顯色20s后每10s觀察一次，至條帶明顯或有本底出現(xiàn)時將膜揭起置去離子水中漂洗后放濾紙上晾干即可觀察與掃描。

 

七．增強敏感性

若目的條帶未出現(xiàn)，或很淡，可試用以下方法增強發(fā)光強度：

1． 用清水漂洗膜數(shù)分鐘，重加發(fā)光液進行曝光，可延長曝光時間。

2． 將膜在PBST或TTBS中洗滌30min或更長，期間至少換2次液。

3． 封閉40~60min

4． 一抗雜交，室溫1h。37℃ 1h 會更強，但可能增加非特異條帶。

5． PBST或TTBS洗膜20min，期間換2次液。

6． 二抗雜交，37℃ 1h。

7． PBST或TTBS洗膜20min，期間換2次液。

8． 發(fā)光鑒定。

9． 若條帶仍未出現(xiàn)或很淡，可以再用PBST或TTBS洗滌膜20min，期間換2次液。

10．三抗雜交，室溫1h。37℃ 1h 會更強，但可能增加非特異條帶。三抗即抗二抗的二抗，比如二抗用羊抗兔，此時三抗可以選擇兔抗羊或鼠抗羊等。

11．PBST或TTBS洗滌膜20min，期間換2次液。

12．發(fā)光鑒定。

 

八．NC膜的多次使用

一張NC膜可使用多次，對多種蛋白進行雜交，步驟與“七．增強敏感性”相近。

1． 如前次雜交結(jié)果條帶距離本次雜交的蛋白的預計位置差別較大則只需用PBST洗滌掉發(fā)光液（10min×3次）后從一抗雜交開始，后續(xù)步驟同前。

2． 如前次雜交結(jié)果條帶距離本次雜交的蛋白的預計位置較近則需更強的洗滌，可用 strip液（可用雜交袋）于室溫搖動洗滌30min~60min，然后用PBST洗滌10min×3次，再從封閉開始，后續(xù)步驟同前。

3． 對于雜交若干次的膜，如果常規(guī)洗滌方法不易去掉眾多條帶，可用強度更強的自配的strip液（可用雜交袋）于50℃洗滌30min，然后用PBST洗滌10min×3次，再從封閉開始，后續(xù)步驟同前。