細(xì)胞懸浮培養(yǎng)是利用生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)生物制品的核心技術(shù)，是當(dāng)前國(guó)際上生物制品生產(chǎn)的主流模式，其最大優(yōu)勢(shì)是通過(guò)更為精確有效的工藝控制手段，在獲得最大產(chǎn)量的同時(shí)能穩(wěn)步提高產(chǎn)品的質(zhì)量。但該技術(shù)目前在國(guó)內(nèi)尚未得到廣泛應(yīng)用，生物制品生產(chǎn)仍主要采用病毒產(chǎn)率低、生產(chǎn)成本高、勞動(dòng)強(qiáng)度大的轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)方式。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展，利用細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行生物制品生產(chǎn)是生物制藥行業(yè)發(fā)展的必然趨勢(shì)。

1、懸浮培養(yǎng)技術(shù)在生物制藥中的應(yīng)用歷史和現(xiàn)狀

1962年，Capstick等率先對(duì)BHK21細(xì)胞馴化實(shí)現(xiàn)懸浮培養(yǎng)，并用于獸用疫苗生產(chǎn)。1967年，Van Wezel又開(kāi)發(fā)了微載體并實(shí)現(xiàn)在生物反應(yīng)器中大規(guī)模培養(yǎng)貼壁細(xì)胞。到20世紀(jì)80年代，CHO細(xì)胞實(shí)現(xiàn)懸浮培養(yǎng)，治療性抗體生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展極大地推動(dòng)著生物反應(yīng)器在生物制藥行業(yè)中的應(yīng)用，到20世紀(jì)末已進(jìn)入萬(wàn)升級(jí)規(guī)模。

2000年以后，隨著流加培養(yǎng)、灌注培養(yǎng)、個(gè)性化細(xì)胞培養(yǎng)基等技術(shù)的發(fā)展，作為大規(guī)模培養(yǎng)主要設(shè)備的生物反應(yīng)器規(guī)模也趨向大型化和簡(jiǎn)單化。現(xiàn)在，全球10000L及以上體積的反應(yīng)器達(dá)一百多臺(tái)，最大已達(dá)25000L，且?guī)缀醵际强梢苑糯蟮臋C(jī)械攪拌式反應(yīng)器，主要為Genetech、Amgen、BoehringerIngelheim 和Lonza等公司所擁有。2007年全球銷(xiāo)售額最高的6大類(lèi)生物技術(shù)藥物中，有5類(lèi)是經(jīng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)生產(chǎn)的�？v觀國(guó)內(nèi)，人用和獸用疫苗生產(chǎn)企業(yè)已超過(guò)110家，應(yīng)用反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)疫苗的僅4家。一般獸用疫苗企業(yè)采用國(guó)內(nèi)自主開(kāi)發(fā)的650 L和1200 L反應(yīng)器生產(chǎn)口蹄疫疫苗。

2、懸浮培養(yǎng)工藝中的關(guān)鍵技術(shù)
懸浮培養(yǎng)技術(shù)主要包括高表達(dá)細(xì)胞株的獲得、個(gè)性化培養(yǎng)基的研發(fā)、動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器及配套設(shè)施的完善及生產(chǎn)工藝的優(yōu)化等四個(gè)方面。

2.1 細(xì)胞與毒株的馴化

為提高生物制品的產(chǎn)率和安全有效性，在生物反應(yīng)器中繁殖的病毒與細(xì)胞需要進(jìn)行相互適應(yīng)選擇，針對(duì)不同的毒株及其表達(dá)量篩選適合的宿主細(xì)胞對(duì)于細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)具有重要意義。

為實(shí)現(xiàn)馴化的穩(wěn)定，通常由高密度細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)向低密度細(xì)胞培養(yǎng)，由高濃度血清培養(yǎng)逐漸降低血清濃度進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞馴化時(shí)應(yīng)該注意保持細(xì)胞活力應(yīng)90%以上，測(cè)定細(xì)胞增殖能力的和表達(dá)分泌能力進(jìn)行，避免馴化后的細(xì)胞表達(dá)特性發(fā)生變化。馴化后細(xì)胞的增殖能力、活力及生產(chǎn)能力要能夠滿(mǎn)足工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)的需要。由于特定細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需求不同，實(shí)現(xiàn)其馴化的難易程度也不同，在馴化時(shí)需要選用合適的細(xì)胞培養(yǎng)基，有針對(duì)性地補(bǔ)充某些營(yíng)養(yǎng)成分以滿(mǎn)足細(xì)胞的特定需求，使馴化好的細(xì)胞可以保持其懸浮或是無(wú)血清生長(zhǎng)的特性。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)基的個(gè)性化

在大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)中，維持細(xì)胞高密度甚至無(wú)血清生長(zhǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)含量對(duì)細(xì)胞的增殖、維持至關(guān)重要。在懸浮培養(yǎng)技術(shù)中，不同細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)代謝的特異性不同，細(xì)胞和病毒培養(yǎng)工藝不同，需要抗剪切力、滿(mǎn)足放大功能，還需要提高目標(biāo)生物制品的穩(wěn)定性、表達(dá)量，這些均需要個(gè)性化培養(yǎng)基的支持。我國(guó)銷(xiāo)售的細(xì)胞培養(yǎng)基卻多為20世紀(jì)50年代發(fā)明的MEM、DMEM、199、RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基等，這些目錄產(chǎn)品難以滿(mǎn)足生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的技術(shù)要求，直接影響了生物制藥行業(yè)技術(shù)升級(jí)。從對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物安全性的長(zhǎng)遠(yuǎn)考慮，生物制品生產(chǎn)越來(lái)越傾向采用無(wú)血清無(wú)動(dòng)物組分培養(yǎng)基，因?yàn)闊o(wú)血清培養(yǎng)基杜絕了血清的外源性污染和對(duì)細(xì)胞毒性作用，使產(chǎn)品易于純化、回收率高，國(guó)際上生物制藥生產(chǎn)中，已經(jīng)有50%以上采用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)工藝的研發(fā)

懸浮培養(yǎng)過(guò)程技術(shù)的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用主要是生產(chǎn)工藝的開(kāi)發(fā)和工藝過(guò)程優(yōu)化，維持細(xì)胞生長(zhǎng)和病毒繁殖的最優(yōu)化環(huán)境控制，在懸浮培養(yǎng)技術(shù)中的作用同樣至關(guān)重要。

2.3.1懸浮培養(yǎng)和微載體培養(yǎng)
懸浮培養(yǎng)技術(shù)按細(xì)胞貼壁性分為懸浮細(xì)胞培養(yǎng)和貼壁細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)。懸浮細(xì)胞可以在反應(yīng)器中直接生產(chǎn)增殖，細(xì)胞自由生長(zhǎng)、培養(yǎng)環(huán)境均一、取樣簡(jiǎn)單、培養(yǎng)操作簡(jiǎn)單可控、放大方便、污染率和成本低;而貼壁細(xì)胞在反應(yīng)器中懸浮培養(yǎng)需要借助微載體，細(xì)胞和球體接觸部位營(yíng)養(yǎng)環(huán)境較差，培養(yǎng)、取樣觀察及放大工藝復(fù)雜，成本高。

雖然相對(duì)于懸浮培養(yǎng)，微載體培養(yǎng)復(fù)雜，但與轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)相比仍有很大優(yōu)勢(shì)，能提高生產(chǎn)規(guī)模、產(chǎn)品質(zhì)量和勞動(dòng)效率，因此是貼壁細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的主要手段。常見(jiàn)的微載體有實(shí)體的Cytodex微載體、片狀的DISK微載體及多孔的Cytopore微載體。使用DISK或Cytopore時(shí)細(xì)胞貼附于載體內(nèi)部生長(zhǎng)，表面細(xì)胞較少，難以使用細(xì)胞消化等方法將載體和細(xì)胞進(jìn)行分離，且反應(yīng)器放大工藝?yán)щy，不適合非釋放病毒的培養(yǎng)。而Cytodex比較適應(yīng)罐倒罐的反應(yīng)器放大工藝，目前報(bào)道的貼壁細(xì)胞生產(chǎn)工藝的最佳形式是機(jī)械攪拌式反應(yīng)器實(shí)體微載體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)最有效的優(yōu)化工藝和最適宜的工藝設(shè)計(jì)，其最佳工藝設(shè)計(jì)體現(xiàn)于高密度連續(xù)灌流培養(yǎng)。

2.3.2懸浮培養(yǎng)方式
選擇反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)方式需要考慮細(xì)胞和病毒的關(guān)系、產(chǎn)物穩(wěn)定性、細(xì)胞培養(yǎng)基或添加物的選擇、細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模等幾個(gè)因素。按照培養(yǎng)方式分為批培養(yǎng)、流加培養(yǎng)及灌注培養(yǎng)。

批培養(yǎng)能直觀反映細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的生長(zhǎng)、代謝變化，操作簡(jiǎn)單，但初期代謝廢產(chǎn)物較多，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)密度不高;流加培養(yǎng)操作簡(jiǎn)單、產(chǎn)率高、容易放大，應(yīng)用廣泛，但需要進(jìn)行流加培養(yǎng)基的設(shè)計(jì);灌注培養(yǎng)的培養(yǎng)體積小，回收體積大，產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時(shí)間短，可及時(shí)回收到低溫下保存，利于保持產(chǎn)品的活性，但操作比較繁雜、細(xì)胞培養(yǎng)基利用效率低、旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器容易堵塞等。不同的病毒采用的培養(yǎng)方式不同，如對(duì)于分泌型且產(chǎn)品活性降低較快的生物制品，宜采用灌注培養(yǎng)，且灌注培養(yǎng)也更適宜于微載體培養(yǎng)。

同一生物制品由于其營(yíng)養(yǎng)環(huán)境的不同，其生產(chǎn)工藝也可能發(fā)生變化，如BHK21細(xì)胞生產(chǎn)口蹄疫病毒，低血清培養(yǎng)時(shí)采用批培養(yǎng)，接毒前需要更換無(wú)血清的維持液;而無(wú)血清培養(yǎng)過(guò)程中無(wú)需換液，配合流加培養(yǎng)可能效果更好。

3、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)在畜禽疫苗中的應(yīng)用
目前疫苗免疫是控制動(dòng)物傳染病的重要措施之一。怎樣提高疫苗質(zhì)量，降低疫苗成本已成為各大動(dòng)物疫苗生產(chǎn)企業(yè)關(guān)注的焦點(diǎn)。工業(yè)化細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)疫苗是提高疫苗質(zhì)量，降低成本的有效手段。

3.1 豬病毒病疫苗
狂犬病毒在2 L的生物反應(yīng)器繁殖，病毒最大滴度能夠達(dá)到1.38×108pfu/ mL，且生產(chǎn)的疫苗質(zhì)量達(dá)到WHO要求。無(wú)血清微載體細(xì)胞培養(yǎng)有利于腸炎病毒繁殖和疫苗生產(chǎn)。同樣有不少關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)大規(guī)模生產(chǎn)豬偽狂犬、豬藍(lán)耳病、豬口蹄疫、豬瘟、豬細(xì)小病毒病等疾病疫苗的報(bào)道。

3.2 禽病毒病疫苗
禽類(lèi)疫苗主要通過(guò)SPF雞胚生產(chǎn)，但雞胚生產(chǎn)疫苗需要消耗大量SPF雞胚，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，易污染，且每枚SPF雞胚一次只能注射一個(gè)病毒毒株。因此，SPF雞胚生產(chǎn)疫苗的效率很低。我國(guó)已經(jīng)能夠通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)出符合《中華人民共和國(guó)獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》的雞傳支H120細(xì)胞弱毒苗。楊濤等也報(bào)道了禽流感病毒在MDCK細(xì)胞中大規(guī)模增殖規(guī)律。國(guó)外有不少關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)禽馬立克病毒、傳染性法氏囊病、傳染性喉氣管炎、產(chǎn)蛋下降綜合征病等疾病疫苗的報(bào)道。

4、展望
應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，快速實(shí)現(xiàn)懸浮培養(yǎng)技術(shù)在疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用只是搭建了一個(gè)升級(jí)工藝的平臺(tái)，而不是最終目的，行業(yè)和企業(yè)發(fā)展真正的動(dòng)力是新獸藥、新疫苗、新工藝以及配套技術(shù)的創(chuàng)新。

例如無(wú)血清培養(yǎng)基的開(kāi)發(fā)和無(wú)血清培養(yǎng)病毒生產(chǎn)技術(shù)的開(kāi)發(fā);利用合適的培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)染或馴化技術(shù)實(shí)現(xiàn)貼壁細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)構(gòu)建;新宿主細(xì)胞表達(dá)品種開(kāi)發(fā)，例如同一種產(chǎn)品采用新的宿主細(xì)胞表達(dá)或是開(kāi)發(fā)一種高效表達(dá)的宿主細(xì)胞適應(yīng)幾種產(chǎn)品的表達(dá)等。總而言之，整合行業(yè)力量，快速實(shí)現(xiàn)懸浮培養(yǎng)技術(shù)在疫苗生產(chǎn)中的升級(jí)換代是未來(lái)幾年我國(guó)生物制藥行業(yè)發(fā)展的重點(diǎn)。這個(gè)過(guò)程應(yīng)重視成熟技術(shù)、成功率，減少和避免時(shí)間、資金、人力等資源的浪費(fèi)，減少機(jī)會(huì)成本，搶占市場(chǎng)先機(jī)。

懸浮培養(yǎng)技術(shù)的升級(jí)將導(dǎo)致行業(yè)整合與重組，生物制藥行業(yè)將出現(xiàn)明顯的集約化趨勢(shì)，有實(shí)力的企業(yè)將不斷以創(chuàng)新新藥、新技術(shù)研發(fā)為基礎(chǔ)和核心競(jìng)爭(zhēng)力，同時(shí)借助資金實(shí)力整合制造和營(yíng)銷(xiāo)體系，成為真正意義上的龍頭。