中國(guó)工程院院士、第二軍醫(yī)大學(xué)王紅陽教授課題組長(zhǎng)期從事惡性腫瘤的基礎(chǔ)與臨床研究，對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子病理機(jī)制和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有重要建樹。近期，該實(shí)驗(yàn)室使用Arraystar LncRNA芯片發(fā)現(xiàn)了與肝癌干細(xì)胞的自我更新相關(guān)的分子--Lnc-DILC。高表達(dá)的Lnc-DILC可以競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合IL-6，阻礙NF-KB /IL-6復(fù)合物形成，影響下游STAT3的表達(dá)，使肝癌干細(xì)胞自我更新受阻。該研究成果發(fā)表在Journal of hepatology (IF:10.59)。（芯片實(shí)驗(yàn)由康成提供技術(shù)服務(wù)）

研究背景

    肝癌（HCC）是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，肝部切除手術(shù)是治療肝癌首選方法，術(shù)后復(fù)發(fā)率高是造成患者預(yù)后不良的主要原因。癌癥的復(fù)發(fā)可能跟具有自我更新、自我保護(hù)、抗凋亡等特點(diǎn)的癌癥干細(xì)胞相關(guān)。研究肝癌干細(xì)胞(LCSCs)被認(rèn)為是了解肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的途徑之一。LncRNA是一類長(zhǎng)度超過200nt的非編碼RNA分子。許多研究證明LncRNA可以與癌癥相關(guān)基因相互作用，在多種腫瘤的發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮重要功能。LCSCs中l(wèi)ncRNA的相關(guān)研究報(bào)道目前比較少，該篇文章的研究預(yù)示著Lnc-DILC不僅可以作為肝癌預(yù)后標(biāo)志物，也有作為治療靶點(diǎn)的可能。

研究思路
    文章使用三種肝癌細(xì)胞系（Huh7, HepG2, CSQT-2）進(jìn)行肝癌干細(xì)胞（LCSCs）培養(yǎng)，通過美國(guó)Arraystar Human LncRNA芯片篩選肝癌細(xì)胞(HCC)和LCSCs，獲得差異表達(dá)的443個(gè)LncRNA，449個(gè)mRNA。在三組細(xì)胞系中，LncRNA-DILC在LCSCs中表達(dá)均下調(diào)，qRCR驗(yàn)證結(jié)果與芯片相符。共表達(dá)分析(CNC)發(fā)現(xiàn)LncRNA-DILC與多個(gè)基因相互作用，qRCR驗(yàn)證其表達(dá)與肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物-EpCAM/CD24的表達(dá)負(fù)相關(guān)。確認(rèn)LncRNA-DILC為后續(xù)研究對(duì)象，通過RACE確認(rèn)序列信息。
    為了進(jìn)一步研究LncRNA-DILC在LCSCs自我更新中的作用，構(gòu)建過表達(dá)和敲低LncRNA-DILC的肝癌細(xì)胞進(jìn)行LCSCs培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)敲低LncRNA-DILC的肝癌細(xì)胞中檢測(cè)到的EpCAM/CD24表達(dá)量和多能性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（如Oct-4）的表達(dá)量均高于過表達(dá)組，且形成LCSCs數(shù)量多，增殖快。將敲低和過表達(dá)的LncRNA-DILC的LCSCs注射裸鼠皮下組織成瘤，觀察到高表達(dá)的LncRNA-DILC顯著抑制了移植瘤的體積，說明其在LCSCs形成的癌擴(kuò)散中起作用。
    作者通過PCR Array 篩選到一些在肝癌干細(xì)胞中高表達(dá)的信號(hào)通路，Western驗(yàn)證LncRNA-DILC可以與JAK2/STAT3通路互作。對(duì)肝癌干細(xì)胞進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，藥物處理實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)LncRNA-DILC抑制STAT3表達(dá)，影響STAT3入核，并降低了LCSCs的耐藥性。癌干細(xì)胞中IL-6可以激活JAK2/STAT3的表達(dá)，該實(shí)驗(yàn)也觀察到IL-6與LncRNA-DILC的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。序列分析，得到LncRNA-DILC能與IL-6啟動(dòng)子序列互補(bǔ)配對(duì)。RNA pull down驗(yàn)證二者結(jié)合，設(shè)計(jì)與IL-6相同序列，轉(zhuǎn)染過表達(dá)LncRNA-DILC的LCSCs,發(fā)現(xiàn)其對(duì)IL-6的抑制作用消失，而過表達(dá)突變的結(jié)合序列沒有該效果。進(jìn)一步，作者檢測(cè)了NF-kB與IL-6的結(jié)合受過表達(dá)的LncRNA-DILC的抑制，從而，揭示了LCSCs中LncRNA-DILC的分子作用機(jī)理。
    臨床應(yīng)用方面，作者對(duì)195例肝癌患者癌和癌旁組織LncRNA-DILC的表達(dá)進(jìn)行研究，LncRNA-DILC在癌癥樣本中表達(dá)量低，與肝癌干細(xì)胞特異膜蛋白EpCAM/CD24含量負(fù)相關(guān)。對(duì)肝癌病人的預(yù)后效果具有很好的指示作用，可以作為預(yù)后標(biāo)志物。

技術(shù)路線

結(jié)果展示

圖一、A對(duì)芯片檢測(cè)到的LCSCs中差異表達(dá)的LncRNA和mRNA進(jìn)行共表達(dá)分析，找到和多個(gè)基因相互作用的重要LncRNA分子，結(jié)合芯片數(shù)據(jù)進(jìn)一步篩選
B對(duì)篩選的Lnc-DILC分子進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，結(jié)果與芯片一致。

圖二、左圖 臨床樣本驗(yàn)證，LncRNA-DILC在肝癌組織中表達(dá)顯著低于癌旁組織 右圖 KM曲線顯示LncRNA-DILC的表達(dá)與預(yù)后效果顯著相關(guān)，LncRNA-DILC的表達(dá)降低預(yù)后效果差。

圖三、LncRNA-DILC在肝癌干細(xì)胞擴(kuò)增中的作用機(jī)制示意圖

研究意義
    該研究揭示了高表達(dá)的LncRNA-DILC通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合IL-6的啟動(dòng)子，抑制NF-kB與IL-6的復(fù)合體形成，從而降低肝癌干細(xì)胞IL-6的表達(dá)，阻礙下游JAK2/STAT3通路激活，最終抑制肝癌干細(xì)胞的擴(kuò)張。同時(shí)，大量肝癌的臨床標(biāo)本研究表明，LncRNA-DILC的低表達(dá)與肝癌的預(yù)后不良顯著相關(guān)，為肝癌的治療提供了潛在的靶點(diǎn)和預(yù)后生物標(biāo)記物。

作者介紹
    王紅陽院士，東方肝膽外科研究所常務(wù)副所長(zhǎng)，生物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中心及綜合治療二科主任、教授，兼任國(guó)務(wù)院學(xué)位辦生物學(xué)科評(píng)議組委員、國(guó)家自然科學(xué)基金委聘任評(píng)審專家、國(guó)家癌基因及其相關(guān)基因重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任、中科院分子細(xì)胞生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室學(xué)術(shù)委員會(huì)副主任、上海交通大學(xué)兼職教授和《中華實(shí)驗(yàn)外科雜志》副主編等職。發(fā)表論文80余篇，獲國(guó)家自然科學(xué)二等獎(jiǎng)、上海市“科技精英”、何梁何利科技進(jìn)步獎(jiǎng)、軍隊(duì)科技進(jìn)步一等獎(jiǎng)和上海市醫(yī)學(xué)科學(xué)一等獎(jiǎng)。

原文出處
Long Non-coding RNA DILC Represses Self-renewal of Liver Cancer StemCells via Inhibiting Autocrine IL-6/STAT3 Axis.J Hepatol.2016.